Protocolo de la PCR convencional

Cómo hacer la PCR

Una configuración convencional de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) consta de cuatro pasos:

1. La agregación de los reactivos o mezclas maestras necesarios y la plantilla a los tubos de PCR.
2. Mezcla y centrifugación.
   *Añada aceite mineral para evitar la evaporación en un termociclador sin tapa calefactora.
3. Amplificación según los parámetros del termociclador y el cebador.
4. Evaluación del ADN amplificado mediante electroforesis en gel de agarosa seguida de tinción con bromuro de etidio.

Estos pasos se presentan a continuación con mayor detalle junto con los materiales y consejos sobre la selección de los reactivos. Este es un protocolo de PCR básico utilizando la ADN polimerasa Taq.

Pasos de la PCR y componentes esenciales

La resolución de problemas de una reacción de PCR implica muchos factores. Al ver esta animación entenderá cómo la selección de los componentes y las condiciones de ciclación adecuados a sus requisitos puede contribuir a lograr resultados óptimos.

Encontrará más protocolos para otras polimerasas o técnicas avanzadas de PCR en la sección Protocolos de nuestra Guía de tecnologías de PCR.

En nuestra página de conceptos básicos de la PCR encontrará más información sobre la PCR convencional, incluido en qué consiste.

Reactivos: ¿Qué se necesita para una PCR?

Reactivo utilizado en la PCR	Producto recomendado
ADN polimerasa Taq	Seleccione la ADN polimerasa Taq según las preferencias del usuario. (Consulte la tabla de polimerasas Taq que se muestra a continuación).
Agua de calidad para PCR	Agua de calidad analítica para PCR
Cebadores diluidos a la concentración de trabajo	Reservas de trabajo a 10 µM son suficientes para la mayoría de los análisis.
Oligonucleótidos	Oligonucleótidos a medida
ADN que se desea amplificar	Proporcionado por el investigador
Pipetas específicas
Termociclador	Con bloque de varios tamaños de pocillo o en multiformato
Puntas de pipeta con filtro estériles
Tubos de microcentrífuga estériles con tapón de rosca de 1,5 ml	Tubos de microcentrífuga Corning® con tapón de rosca
Tubos o placas de PCR	Elija para que encajen en el ciclador:
	Tubos individuales de PCR de 200 µl de pared fina
	Tiras de tubos de 200 µl
	Placas multipocillo y precintos de placa
Mezcla de dNTP	Mezcla de desoxinucleótidos que contenga dATP, dCTP, dGTP y dTTP 10 mM *las mezclas preparadas ya incluyen los dNTP

¿Qué es la polimerasa Taq?

La ADN polimerasa Taq es una enzima termoestable procedente de la bacteria termófila Thermus aquaticus. Se  utiliza habitualmente para amplificar fragmentos de ADN en la PCR. La enzima es una forma recombinante, expresada en E. coli. Es capaz de soportar el calentamiento repetido a 95 °C (como exige la técnica de la PCR) sin pérdida significativa de actividad. La enzima tiene un peso molecular de aproximadamente 94 kDa según SDS-PAGE sin actividad endonucleasa ni exonucleasa detectable. Tiene actividad ADN polimerasa 5'→3' y actividad exonucleasa 5'→3'. Cada lote de ADN polimerasa Taq se prueba para amplificación por PCR y secuenciación bicatenaria. La enzima se suministra a 5 unidades/µl y viene con un tampón de reacción optimizado por diez.

ADN polimerasa Taq convencional

Utilice la tabla siguiente para seleccionar una mezcla apropiada de ADN polimerasa Taq para sus condiciones de reacción. Elija entre formulaciones transparentes o teñidas de rojo con y sin cloruro de magnesio (MgCl₂) o una mezcla preparada previamente o una mezcla maestra con tampón y dNTP.

Que contiene MgCl2		MgCl2 aparte	Mezcla preparada ReadyMix
Formulación transparente sin colorante	Con colorante rojo para carga directa en geles	Formulación transparente sin colorante	Con colorante rojo para carga directa en geles	Formulación transparente sin colorante
ADN polimerasa Taq deThermus aquaticus(D1806)	ADN polimerasa REDTaq® (D4309)	DNA polimerasa Taq deThermus aquaticus sin MgCl2 (D4545)	Mezcla de reacción para PCR REDTaq® ReadyMix™ (R2523)	Mezcla de reacción para PCR Readymix™ Taq (P4600)

Definición de unidad: Una unidad incorpora 10 nmol de trifosfatos de desoxirribonucleósidos totales en ADN precipitable en ácido en 30 minutos a 74 °C.

Procedimiento: Pasos de la PCR

Las condiciones óptimas para la concentración de la ADN polimerasa Taq, la plantilla de ADN, los cebadores y el MgCl₂ dependerán del sistema que se utilice. Puede ser necesario determinar las condiciones óptimas para cada componente individual. Esto es especialmente cierto para la ADN polimerasa Taq, los parámetros de ciclación y la concentración de MgCl₂. Se recomienda valorar la enzima y el MgCl₂ para determinar el rendimiento óptimo.

1. Añada los reactivos a un tubo del tamaño adecuado en el orden indicado en la tabla. (Seleccione la tabla apropiada para la configuración de la reacción: reactivo estándar o mezcla preparada). Para un gran número de reacciones, debe configurarse y distribuirse en alícuotas en los tubos de reacción una mezcla maestra sin la plantilla. Al final, debe agregarse la plantilla a los tubos apropiados.
   

Reacción de PCR convencional

Cantidad	Componente	Concentración final
w µl	Agua
5 µl	Tampón de PCR x10(P2192 o P2317)*	1x
1 µl	Mezcla de desoxinucleótidos	200 µM
w µl	Cebador directo (normalmente 15-30 bases de longitud)	0,1 - 0,5 µm
X µl	Cebador inverso (normalmente 15-30 bases de longitud)	0,1 - 0,5 µM
0,5 µl	ADN polimerasa Taq*	0,05 unidades/µl
y µl	Plantilla de ADN (normalmente 10 ng)	200 pg/µl
z µl	MgCl2 25 mM (utilizar sólo con tampón P2317)	0,1-0,5 mM
50 µl	Volumen de reacción total

* Compre el tampón y la Taq polimerasa juntos: D1806, D4309 o D4545

Mezcla preparada para la reacción de PCR

Cantidad	Componente	Concentración final
25 µl	Mezcla preparada Readymix (R2523oP4600)
w µl	Cebador directo (normalmente 15-30 bases de longitud)	0,1 - 0,5 µM
X µl	Cebador inverso (normalmente 15-30 bases de longitud)	0,1 - 0,5 µM
y µl	Plantilla de ADN (normalmente 10 ng)	200 pg/µl
z µl	Agua
50 µl	Volumen de reacción total

2. Mezcle suavemente en Vórtex y centrifugue brevemente para recoger todos los componentes en el fondo del tubo.

Nota: añada 50 µl de aceite mineral a la parte superior de cada tubo para evitar la evaporación si utiliza un termociclador sin tapa calefactora.

3. Amplificación. Los parámetros de amplificación variarán en función de los cebadores y el termociclador utilizados. Quizá sea necesario optimizar el sistema para cada cebador, la plantilla y el termociclador.

Parámetros de ciclado típicos

Se recomiendan 25-30 ciclos de amplificación.

Paso de PCR	Temperatura (°C)	Duración
Desnaturalización de la plantilla	94 °C	1 min
Hibridación de cebadores	55 °C	2 min
Extensión	72 °C	3 min

4. El ADN amplificado se puede evaluar mediante electroforesis en gel de agarosa y posterior tinción con bromuro de etidio.

      Nota: la capa de aceite mineral puede quitarse mediante una sola extracción con cloroformo (1:1), recuperando la fase acuosa.

Reactivos para la electroforesis de los ácidos nucleicos

• Agarosa (geles prefabricados, polvo, etc.)
• Tampón como MOPS-EDTA-acetato sódico, tris-acetato-EDTA (TAE) o tris-borato-EDTA (TBE)
• Disolución de carga en gel y tampón de carga de muestras para ARN
• Tinción o colorante para electroforesis como el bromuro de etidio

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

Label License Statement

ADVERTENCIA PARA EL COMPRADOR: EXENCIÓN DE RESPONSABILIDAD DE LICENCIA

Mediante la compra de este producto no se transfiere licencia alguna bajo ninguna de las patentes de EE.UU. números 5.804.375, 5.994.056, 6.171.785, 6.214.979, 5.538.848, 5.723.591, 5.876.930, 6.030.787 y 6.258.569, y las correspondientes patentes fuera de los Estados Unidos, o cualquier otra patente o solicitud de patente, relacionada con la 5’ Nucleasa y los procesos de colorante de unión al ADN bicatenario. Si desea más información, póngase en contacto con Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, EE