Método convencional recomendado para aislar células mononucleares

La separación celular utilizando productos Ficoll-Paque se puede llevar a cabo en una amplia gama de volúmenes de muestras sanguíneas. Con su alto rendimiento, este método se puede adaptar al procesamiento de cantidades muy pequeñas de sangre, como las que pueden obtenerse de los niños. Para una máxima reproducibilidad de la separación, se recomienda utilizar un procedimiento normalizado. El siguiente procedimiento ha sido evaluado en nuestros laboratorios con Ficoll-Paque PLUS y se recomienda para la separación de muestras de sangre sanas. Pueden hacerse fácilmente cambios simples para adaptarse a un sistema de centrifugación concreto. Se recomienda el mismo procedimiento cuando se separan las células utilizando Ficoll-Paque PREMIUM, Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 y Ficoll-Paque PREMIUM 1.073.

Para normalizar la técnica, primero deben elegirse el volumen sanguíneo y el diámetro del tubo de centrífuga. Estos factores determinan la altura de la muestra de sangre en el tubo y por consiguiente el tiempo de centrifugado. Aumentar la altura de la muestra de sangre en el tubo aumenta la contaminación por los glóbulos rojos. La separación, sin embargo, no se ve afectada de manera apreciable por el cambio del diámetro del tubo. Por consiguiente, se puede separar un volumen mayor con el mismo grado de purificación en un tubo de mayor diámetro si la altura de la muestra de sangre en el tubo y el tiempo de separación se mantienen constantes.

El rendimiento y el grado de pureza de las células mononucleares dependen en gran medida de la eficiencia de la eliminación de los glóbulos rojos.

Cuando los eritrocitos de la sangre entera se agregan, algunas células mononucleares quedan atrapadas en los grupos y por lo tanto sedimentan con los eritrocitos. Esta tendencia a atrapar las células mononucleares se reduce al diluir la sangre. La dilución brinda un mejor rendimiento de las células mononucleares y reduce el tamaño de los coágulos de glóbulos rojos. La agregación de los eritrocitos aumenta a temperaturas más elevadas (37 °C), lo que reduce el rendimiento de las células mononucleares. A temperaturas más bajas (4 °C), sin embargo, la tasa de agregación disminuye pero el tiempo de separación aumenta, lo que también disminuye el rendimiento de las células mononucleares. Una temperatura de compromiso de 18°C a 20°C proporciona resultados óptimos.

Equipo y disoluciones requeridas pero no proporcionadas

1. Disolución salina equilibrada estéril u otras disoluciones salinas estándar (véase Preparación de los reactivos).
2. Centrífuga con rotor oscilante (el freno debe estar apagado).
3. Tubos de centrífuga y pipetas estériles.
4. Agujas y jeringas estériles.
5. Disolución de lisis de eritrocitos de elección (si se quieren aislar los granulocitos).

Preparación de los reactivos

Diluyente y disolución de lavado
La disolución salina equilibrada para la dilución de la sangre y el lavado celular se puede elaborar según las instrucciones que se muestran a continuación. También se pueden utilizar otros diluyentes y líquidos de lavado como la disolución salina tamponada con fosfato sin Ca²⁺/mg²⁺ (por ejemplo, PBS de Dulbecco), disoluciones salinas (por ejemplo, Hank’s) o medios de cultivo celular (por ejemplo, RPMI 1640).

Disolución salina equilibrada
Para preparar la disolución salina equilibrada, mezcle un volumen de la disolución madre A con nueve volúmenes de la disolución madre B y esterilice. Se deben procesar al menos 20 ml para cada muestra. También se pueden utilizar otras disoluciones salinas estándar estériles.

Disolución A	Concentración (M)	Concentración [g/l]
D-glucosa anhidra	5,5 × 10-3 M (0,1%)	1,0
CaCl2.2H2O	5,0 × 10-5 M	0,0074
MgCl2.6H20	9,8 × 10-4 M	0,1992
KCl	5,4 × 10-3 M	0,4026
TRIS	0,145 M	17,565

Disuelva en aproximadamente 950 ml de agua destilada y añada HCl concentrado hasta que el pH sea 7,6 antes de ajustar el volumen a 1 l.

Disolución B	Concentración (M)	Concentración [g/l]
NaCl	0,14	8.19

Para preparar la disolución salina equilibrada, mezcle 1 volumen de la disolución A con 9 volúmenes de la disolución B. Prepare la disolución nueva cada semana. Se pueden utilizar otras disoluciones salinas estándar.

Producto Ficoll-Paque
Caliente el medio de gradiente de densidad Ficoll-Paque a 18 °C - 20 °C antes de usarlo. Para muestras superiores a 3 ml, véanse las Notas.

Preparación de la muestra
Debe utilizarse sangre fresca para garantizar una gran viabilidad de las células mononucleares aisladas. Prepare la muestra a 18°C - 20°C.

1. A un tubo de centrífuga de 10 ml, añada 2 ml de sangre desfibrinada o tratada con anticoagulante y un volumen igual de disolución salina equilibrada (volumen final 4 ml).
2. Mezcle la sangre y el tampón invirtiendo el tubo varias veces o extrayendo y soltando la mezcla con una pipeta.

Procedimiento para el aislamiento de las células mononucleares

1. Invierta la botella de medios Ficoll-Paque varias veces para asegurar una mezcla completa.
   Para extraer los medios Ficoll-Paque con una jeringa: retire la tapa de polipropileno colocada a presión e introduzca la aguja de la jeringa a través del tabique de goma (Figura 1).
   Para extraer los medios Ficoll-Paque con una pipeta: retire la tapa de polipropileno colocada a presión. Levante el anillo de aluminio. Quite el precinto metálico. Retire el anillo de plata.
   Quite el cierre de goma. Utilizando técnicas asépticas, retire el volumen requerido de medios Ficoll-Paque (Figura 2).
2. Añada los medios Ficoll-Paque (3 ml) al tubo de centrífuga.
3. Coloque con cuidado la muestra de sangre diluida (4 ml) sobre la disolución de medios Ficoll-Paque (Figura 3).
   Importante: al colocar la muestra, no mezcle la disolución de medios Ficoll-Paque con la muestra de sangre diluida.
4. Centrifugue a 400 g durante 30 a 40 min a 18°C - 20°C (el freno debe estar apagado).
5. Extraiga la capa superior que contiene el plasma y las plaquetas utilizando una pipeta estéril, dejando la capa de células mononucleares intacta en la interfaz (Figura 4 y Figura 5). La capa superior, que contiene el plasma, se puede guardar para su uso posterior.
6. Transfiera la capa de células mononucleares a un tubo de centrífuga estéril con una pipeta estéril.

Figura 1. Retirada de la tapa de polipropileno y el anillo de plata

Figura 2. Extracción de los medios Ficoll-Paque

Figura 3. Muestra de sangre colocada sobre los medios Ficoll-Paque

Figura 4. Antes de retirar la capa superior.

Figura 5. Después de haber retirado la capa superior (plasma).

Lavado del aislado celular

1. Estime el volumen de las células mononucleares transferidas. Agregue al menos 3 volúmenes (~ 6 ml) de la disolución salina equilibrada a las células mononucleares en el tubo de centrífuga.
2. Suspenda las células extrayéndolas y volviendo a meterlas suavemente con una pipeta.
3. Centrifugue a entre 400 y 500 x g durante 10 a 15 minutos a 18 °C - 20 °C.

Nota: una centrifugación a alta velocidad aumenta la recuperación de células mononucleares. Sin embargo, si también es importante deshacerse de las plaquetas, se recomienda una menor velocidad de centrifugación (60 a 100 x g).

1. Retire el sobrenadante.
2. Vuelva a suspender las células mononucleares en 6 a 8 ml de una disolución salina equilibrada.
3. Centrifugue a 400 - 500 x g (o 60 - 100 x g para la eliminación de las plaquetas) durante 10 min a 18 °C - 20 °C..
4. Retire el sobrenadante.
5. Resuspenda el sedimento celular en el medio apropiado para la aplicación.

Procedimiento para el aislamiento de granulocitos

1. Realice centrifugación en gradiente de densidad usando medios Ficoll-Paque como se acaba de describir en Procedimiento para el aislamiento de las células mononucleares, pasos 1 a 6.
2. Extraiga la capa superior del medio Ficoll-Paque con una pipeta estéril, dejando sin alterar la capa de leucocitos granulocíticos sobre la capa de eritrocitos.
3. Recoge la fina capa leucocitos granulocíticos con una pipeta y transfiéralos a un tubo de centrífuga estéril.
4. Resuspenda las células en al menos cinco volúmenes de disolución salina equilibrada y centrifugue a 400 x g durante 15 minutos.
5. Lise los eritrocitos restantes con cualquier disolución de lisis de glóbulos rojos de elección.
6. Centrifugue los granulocitos a 400 - 500 x g durante 10 a 15 minutos a 18 °C - 20 °C.
7. Retire el sobrenadante.
8. Vuelva a suspender los granulocitos en 6 a 8 ml de una disolución salina equilibrada.
9. Centrifugue a 400 - 500 x g durante 10 minutos a 18 °C - 20 °C.
10. Retire el sobrenadante.
11. Resuspenda el sedimento celular en el medio apropiado para la aplicación.

Notas
Anticoagulantes: la heparina, el EDTA, el citrato, el citrato ácido dextrosa (ACD) y el citrato fosfato dextrosa (CPD) pueden usarse como anticoagulantes de la muestra sanguínea. La sangre desfibrinada no requiere anticoagulante. La desfibrinación, sin embargo, provoca un menor rendimiento de células mononucleares y puede causar un aumento de la contaminación por los glóbulos rojos³. También causa pérdida selectiva de monocitos.

Bøyum ha encontrado que se obtiene una preparación de células mononucleares ligeramente más pura si se utiliza EDTA como anticoagulante en lugar de heparina³. También se ha observado en la purificación de células mononucleares de sangre no periférica que la adición de heparina puede causar gelificación de las suspensiones celulares⁴. La sangre estabilizada con citrato puede producir ARN y ADN de mejor calidad que otros anticoagulantes, y un mayor rendimiento de células mononucleares. La heparina afecta a la proliferación de las células T y se une a muchas proteínas. El EDTA es bueno para los análisis con ADN, pero influye en la concentración de Mg2+ y causa problemas para el análisis citogenético⁵. También se ha demostrado que el rendimiento de ARN es mayor en EDTA-sangre que en heparina-sangre⁶.

Volumen sanguíneo: se pueden procesar grandes volúmenes de sangre con la misma eficiencia de separación si se utilizan tubos de centrífuga de mayor diámetro, manteniendo aproximadamente las mismas alturas de medios Ficoll-Paque (2,4 cm) y muestra de sangre (3,0 cm) que en el método estándar descrito antes. El aumento del diámetro del tubo no afecta el tiempo de separación requerido.

Conservación de las muestras de sangre: las muestras sanguíneas deben carecer de coágulos y procesarse lo antes posible después de su recogida para garantizar resultados óptimos. Los retrasos en el procesamiento de la sangre pueden provocar pérdida de viabilidad, menores recuperaciones de células y más granulocitos o eritrocitos contaminantes. De hecho, se ha comunicado que la conservación durante 24 horas a temperatura ambiente tiene como consecuencia un menor rendimiento de linfocitos, alteración en la expresión de los marcadores de superficie y una menor respuesta a la estimulación mitógena^5,7,8. Eliminación de las células muertas: las células muertas se eliminan durante el aislamiento celular utilizando Ficoll-Paque PLUS^9,10,58.

Densidad y temperatura: la temperatura a la que se llevan a cabo las separaciones por gradiente de densidad se ve afectada naturalmente por la temperatura ambiente, la temperatura de la centrífuga, la temperatura de los medios de gradiente de densidad y la temperatura de la muestra líquida. A veces también puede haber confusión con respecto a lo que se entiende por temperatura ambiente (por ejemplo, en Europa puede ser de 20°C y en América del Norte > 20°C). Se sabe que las densidades de los productos Ficoll-Paque disminuyen al aumentar la temperatura. Por ejemplo, Ficoll-Paque PREMIUM (1,077 g/ml) presenta una densidad de 1,0772, 1,0767 y 1,0758 respectivamente a 20°C, 22°C y 25°C.

Muestras de sangre patológica: el método estándar que se acaba de describir se ha desarrollado para la purificación de células mononucleares de sangre periférica de donantes humanos normales y sanos. Se pueden obtener resultados diferentes con muestras tomadas de donantes con infecciones u otras patologías, como el cáncer (véanse otras aplicaciones de Ficoll-Paque PLUS y Ficoll-Paque PREMIUM, página 12).

Eliminación de plaquetas: si es importante eliminar todas las plaquetas de la fracción de células mononucleares, se puede aplicar una segunda centrifugación en un gradiente de sacarosa en capas del 4 % al 20 % sobre Ficoll-Paque PLUS. Este procedimiento eliminará eficazmente cualquier contaminación plaquetaria¹¹. Las plaquetas permanecerán en la parte superior del gradiente de sacarosa y las células mononucleares sedimentarán a través del gradiente de sacarosa hasta la parte superior de la capa de Ficoll-Paque PLUS. Por otro lado, las plaquetas también pueden eliminarse por agregación con adenosina-5’-difosfato (ADP) antes de separar las células mononucleares¹².

Resolución de problemas de rendimiento inadecuado
Si se utiliza de acuerdo con el procedimiento estándar recomendado, cabe esperar que Ficoll-Paque PLUS y Ficoll-Paque PREMIUM proporcionen un aislamiento sin problemas de las células mononucleares de sangre periférica humana con resultados como los mostrados en la página 2. Como se mencionó anteriormente, Ficoll-Paque PREMIUM 1,073 y Ficoll-Paque PREMIUM 1,084 inducirán el aislamiento de preparaciones celulares que tengan subconjuntos de células mononucleares de densidad ligeramente diferente. Sin embargo, desviaciones en ciertos parámetros experimentales pueden provocar resultados deficientes; la tabla de resolución de problemas que se muestra a continuación está pensada para contribuir a la identificación y la corrección rápidas del problema causante del menor rendimiento.

Desviación en el rendimiento	Probable origen del problema	Comentarios
Aumento de los glóbulos rojos y contaminación de los linfocitos.	A. Temperatura demasiado baja.	Las densidades de todos los productos Ficoll-Paque son mayores a baja temperatura (véase Notas, Densidad y temperatura) y los glóbulos rojos se agregan peor, por lo que se evita que los granulocitos y los eritrocitos entren en la capa de medios Ficoll-Paque. Eleve la temperatura a 18°C - 20°C.
	B. Velocidad de centrifugación demasiado lenta o tiempo de centrifugación demasiado corto.	Se debe utilizar el tiempo y la fuerza g adecuados para garantizar la sedimentación completa de las células no linfoides.
Bajo rendimiento y viabilidad de las células mononucleares.	Temperatura demasiado alta.	Los productos Ficoll-Paque son menos densos a altas temperaturas y algunos linfocitos pueden penetrar en la capa de medios Ficoll-Paque. La viabilidad celular también puede verse afectada. Reduzca la temperatura a 18°C - 20°C.
Bajo rendimiento de células mononucleares con viabilidad normal.	Sangre no diluida 1:1 con disolución salina equilibrada; hematócrito inusualmente elevado.	La alta densidad celular se traduce en un gran número de linfocitos atrapados por los agregados de glóbulos rojos. Diluya más la muestra de sangre.
Bajo rendimiento de células mononucleares con mayor contaminación granulocitaria.	Vibración del rotor de la centrífuga, que provoca la agitación del gradiente.	La vibración puede causar un ensanchamiento de la banda celular mononuclear y su mezcla con las células subyacentes. Compruebe que el rotor esté correctamente equilibrado. Elija la velocidad del rotor que evita frecuencias de resonancia naturales.
Bajo rendimiento de células mononucleares, baja viabilidad y contaminación por otros tipos de células.	La muestra contiene células con densidades anómalas; densidades diferentes a las de la sangre humana normal.	Puede encontrarse con muestras de sangre patológica, muestras de sangre no humana, muestras de sangre antigua o muestras que no procedan de sangre periférica. Percoll™ PLUS, un medio para centrifugación en gradiente de densidad, puede ser más adecuado que los productos Ficoll-Paque para tales separaciones.

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