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  • Evaluation of the sensitivity, responsiveness and reproducibility of primary rainbow trout hepatocyte vitellogenin expression as a screening assay for estrogen mimics.

Evaluation of the sensitivity, responsiveness and reproducibility of primary rainbow trout hepatocyte vitellogenin expression as a screening assay for estrogen mimics.

Aquatic toxicology (Amsterdam, Netherlands) (2015-01-07)
Maria T Hultman, Jan Thomas Rundberget, Knut Erik Tollefsen
RESUMEN

Vitellogenin (Vtg) induction in primary fish hepatocytes has been proposed as an in vitro screening assay for ER agonists and antagonists, but has not yet been used extensively as a high-throughput screening tool due to poor reproducibility, sensitivity and overall feasibility. The present work has evaluated the role of seasonal variation, normalization, optimal culture and assay conditions on the sensitivity, responsiveness and reproducibility of in vitro vtg gene mRNA and protein expression in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) primary hepatocytes using the xenoestrogen 17α-ethynylestradiol (EE2) as a test chemical. The results show that primary hepatocytes display a relatively high individual and seasonal variation in both Vtg mRNA and protein induction potential, although less variance was observed in assay sensitivity. Data normalization of assay response to maximum (3 nM EE2) and minimum (DMSO) Vtg production dramatically reduced this variance and led to improved assay reproducibility. A time-dependent response was observed both for mRNA and protein expression, reaching maximum Vtg induction after 96 h of exposure, although reproducible concentration response curves for both Vtg mRNA and protein could be obtained already after 48 h. A need for chemical re-exposure of the hepatocytes was identified to be important for sustaining exposure concentrations in extended studies (>48 h), whereas different plate formats (96, 24 or 6 wells) did not affect the bioassay performance. In conclusion, standardization of hepatocyte bioassay and test conditions as well as data-normalization procedures are proposed to be instrumental for more consistent and comparable results in future use of this in vitro assay.

MATERIALES
Referencia del producto
Marca
Descripción del producto

Sigma-Aldrich
Metanol, suitable for HPLC, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Acetona, ACS reagent, ≥99.5%
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Sigma-Aldrich
Metanol, ACS reagent, ≥99.8%
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Sigma-Aldrich
Acetona, suitable for HPLC, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Metanol, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Acetona, HPLC Plus, for HPLC, GC, and residue analysis, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Tolueno, ACS reagent, ≥99.5%
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Sigma-Aldrich
Bicarbonato de sodio, ACS reagent, ≥99.7%
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Sigma-Aldrich
Metanol, HPLC Plus, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Carbonato de sodio, powder, ≥99.5%, ACS reagent
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Sigma-Aldrich
Tolueno, suitable for HPLC, 99.9%
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Sigma-Aldrich
Tolueno, HPLC Plus, for HPLC, GC, and residue analysis, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Bicarbonato de sodio, powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture
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Sigma-Aldrich
Acetona, Laboratory Reagent, ≥99.5%
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Sigma-Aldrich
Ammonium acetate, ACS reagent, ≥97%
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Sigma-Aldrich
Carbonato de sodio, ACS reagent, anhydrous, ≥99.5%, powder or granules
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Sigma-Aldrich
Bicarbonato de sodio, ReagentPlus®, ≥99.5%, powder
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Sigma-Aldrich
Ammonium acetate, ≥99.99% trace metals basis
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Sigma-Aldrich
Copper(II) sulfate, ReagentPlus®, ≥99%
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Sigma-Aldrich
Metanol, suitable for HPLC, gradient grade, suitable as ACS-grade LC reagent, ≥99.9%
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Sigma-Aldrich
Metanol, puriss. p.a., ACS reagent, reag. ISO, reag. Ph. Eur., ≥99.8% (GC)
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Sigma-Aldrich
Tolueno, puriss. p.a., ACS reagent, reag. ISO, reag. Ph. Eur., ≥99.7% (GC)
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Sigma-Aldrich
Acetona, puriss. p.a., ACS reagent, reag. ISO, reag. Ph. Eur., ≥99.5% (GC)
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Sigma-Aldrich
Carbonato de sodio, ACS reagent (primary standard), anhydrous, 99.95-100.05% dry basis
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Sigma-Aldrich
Metanol, Laboratory Reagent, ≥99.6%
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Sigma-Aldrich
Cloruro de dansilo, BioReagent, suitable for amino acid labeling, powder and chunks, ≥99% (HPLC)
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Sigma-Aldrich
Bicarbonato de sodio, anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, ACS reagent, ≥99.7%
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Sigma-Aldrich
Carbonato de sodio, ReagentPlus®, ≥99.5%
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Sigma-Aldrich
Acetona, suitable for HPLC, ≥99.8%
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Sigma-Aldrich
Ammonium acetate, for molecular biology, ≥98%
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