Espectrometría de masas de proteínas
La espectrometría de masas de proteínas se utiliza ampliamente para analizar muestras biológicas en el descubrimiento de biomarcadores, la investigación proteómica y las aplicaciones clínicas. En comparación con otras técnicas utilizadas para la caracterización a gran escala de proteínas, la espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta principal de la proteómica por su capacidad de adaptación a los análisis complejos.
La espectrometría de masas se utiliza para identificar y caracterizar cuantitativamente las proteínas en función de su estructura, sus modificaciones postraduccionales y sus interacciones.
- La identificación de proteínas implica normalmente la digestión química o enzimática de proteínas en péptidos, que luego se analizan mediante espectrometría de masas y se identifican mediante métodos computacionales o secuenciación.
- Las modificaciones postraduccionales pueden identificarse mediante cambios en la masa de restos de aminoácidos. Los sitios de modificación pueden cartografiarse utilizando secuenciación o métodos computacionales.
- Para el análisis y perfilado de los glucanos, se utilizan métodos enzimáticos o químicos para liberar los restos glucano de las glucoproteínas, seguido de la derivatización de los glucanos liberados para análisis mediante espectrometría de masas.
- Las interacciones proteicas se determinan mediante copurificación por afinidad de una proteína diana específica con cualquier proteína con la que interactúe o se estudian más globalmente utilizando cromatografía de intercambio iónico o de exclusión por tamaño antes del análisis mediante espectrometría de masas.
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Para proteómica cuantitativa, las proteínas o los péptidos pueden marcarse químicamente con isótopos estables utilizando etiquetado masivo en tándem (TMT) e iTRAQ o metabólicamente mediante la incorporación de aminoácidos marcados (SILAC). La comparación de la incorporación de isótopos pesados y ligeros permite la cuantificación relativa mediante la correlación de los picos de la espectrometría de masas con la abundancia de proteínas. Para la cuantificación absoluta, las muestras pueden enriquecerse péptidos sintéticos o patrones de proteínas marcados isotópicamente para el análisis mediante control de reacciones seleccionadas (SRM).
En la espectrometría de masas de proteínas se determinan las masas de diferentes proteínas y péptidos midiendo la relación m/z (masa a carga) de sus iones en fase gaseosa. Los espectrómetros de masas primero convierten las moléculas de proteínas en iones en fase gaseosa utilizando una fuente de iones. A continuación, un analizador de masas separa los analitos ionizados en función de la relación m/z. Un detector registra después el número de iones en cada valor m/z. Suelen utilizarse la MALDI y la ionización por electropulverización (ESI) para ionizar péptidos o proteínas.
Espectrometría masas con MALDI-TOF
La MALDI es un método de ionización en el que se utiliza una matriz de absorción de energía láser para generar iones con una fragmentación mínima de las moléculas de proteínas. Primero, la muestra se mezcla con un material de matriz adecuado. A continuación, se irradia con un láser pulsado, lo que desencadena la ablación y desorción tanto de la muestra como del material de la matriz. Luego se ionizan las moléculas del analito por protonación o desprotonación en los gases sometidos a ablación antes del análisis mediante espectrometría de masas.
Espectrometría de masas de ionización por electropulverización
En la ionización por electropulverización (ESI) se producen iones utilizando una electropulverización en la que se aplica un alto voltaje a la muestra líquida para crear un aerosol, generando iones con una fragmentación mínima de los péptidos y las proteínas. La ionización por electropulverización se suele utilizar cuando se acopla la espectrometría de masas a la cromatografía de líquidos (LC-MS), ya que el eluido de la cromatografía de líquidos puede alimentar directamente al electropulverizador para el procesamiento en tándem.
Procedimiento de trabajo
Digestión y marcaje
Se utilizan proteasas específicas de sitio, como la tripsina, para romper las proteínas en fragmentos pequeños y permitir su identificación mediante comparación de los espectros experimentales con los espectros teóricos de las bases de datos de proteínas o por comparación con patrones analizados. Para la cuantificación relativa, los cultivos celulares pueden marcarse metabólicamente utilizando isótopos estables incorporados a través de la alimentación con aminoácidos, o las muestras pueden marcarse con isótopos estables utilizando métodos químicos. El enriquecimientos de las muestras con péptidos sintéticos isotópicamente marcados permite la cuantificación absoluta mediante el análisis de control de reacciones seleccionadas (SRM).
Calibración y normalización en la espectrometría de masas de proteínas
Los patrones de calibración pueden servir como controles para el análisis de muestras y utilizarse para determinar la identidad de las proteínas, la sensibilidad experimental y la eficacia de la digestión, y para contribuir a la separación cromatográfica y el análisis cuantitativo.
Separación cromatográfica
La cromatografía permite la separación de proteínas y péptidos en muestras más manejables para su análisis. Dado que varios péptidos distintos pueden tener masas similares, normalmente se utiliza la HPLC para evitar la adición simultánea de péptidos con masas muy similares o idénticas al espectrómetro de masas, lo que aumenta el intervalo dinámico general de las mediciones.
Detección y análisis
Antes de su detección y análisis, las proteínas y los péptidos se ionizan mediante MALDI o ESI. Un analizador de masas distingue los iones en función de sus valores m/z. Los patrones de fragmentación resultantes pueden utilizarse para la identificación, y las muestras pueden cuantificarse relativamente mediante la evaluación de los cocientes de intensidad máxima de las muestras diferenciadas por el marcaje isotópico o absolutamente utilizando el análisis de SRM con patrones internos marcados.
Destacados
Cebador para marcaje isotópico estable por aminoácidos en cultivo celular (SILAC)
Procedimiento de la espectrometría de masas y herramientas de supervisión de las proteínas mediante espectrometría de masas
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