Purification d'échantillons
Diverses méthodes de purification physiques ou chimiques peuvent être appliquées pour séparer ou concentrer un analyte cible avant l'analyse. On peut citer notamment l'absorption, l'adsorption, la chromatographie, la distillation, l'extraction, l'échange d'ions, la filtration, la formation de complexes, la cristallisation, le séchage, et bien d'autres encore. Préparer un échantillon avant l'analyse permet de présenter l'échantillon sous un format compatible avec la technique analytique employée, de réduire la complexité de l'échantillon, de retirer les impuretés interférentes et de concentrer l'analyte. Une préparation adaptée de l'échantillon permet d'éviter les colmatages, peut limiter le recours à des méthodes de lavage contraignantes et peut allonger la durée de vie du milieu chromatographique.
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Certaines des techniques de purification les plus courantes décrites ci-dessous sont utilisées au laboratoire pour préparer les échantillons en vue de leur analyse.
Dialyse
La dialyse est une technique de purification permettant d'éliminer les sels et autres molécules de faible poids moléculaire présents dans un échantillon. Elle sert également à échanger la composition du tampon d'un échantillon. La dialyse est une technique passive nécessitant de gros volumes de tampon.
Échange de tampon et dessalage
Le dessalage est une méthode simple qui permet d'éliminer les sels et autres contaminants de faible masse moléculaire présents dans un échantillon. Il sert aussi à échanger le tampon avant ou après différentes étapes chromatographiques, et à éliminer rapidement les réactifs afin de stopper une réaction.
Précipitation fractionnée
La précipitation fractionnée est utilisée pour éliminer les impuretés grossières présentes dans les échantillons de faible volume. Des techniques de précipitation séparent des fractions selon le principe de la solubilité différentielle. Comme les protéines diffèrent de par leur degré d'hydrophobicité, augmenter les concentrations en sels peut renforcer les interactions hydrophobes entre les protéines et provoquer une précipitation.
Extraction
La préparation des échantillons par extraction consiste à isoler les analytes cibles au sein d'un échantillon complexe ou d'un volume d'échantillon beaucoup plus grand. Ce procédé élimine les constituants de l'échantillon qui interfèrent et sont susceptibles de colmater les colonnes de HPLC et de GC. Il augmente également la concentration de l'analyte d'un facteur 100 à 5 000, améliorant ainsi considérablement la sensibilité de la détection. Dans le cadre d'une préparation d'échantillons sélective et spécifique, l'extraction contribue à améliorer la fiabilité de l'analyse chromatographique. L'extraction peut être une extraction liquide-liquide, une extraction en phase solide (SPE), ou une microextraction en phase solide (SPME).
Chromatographie d'affinité
La chromatographie d'affinité permet de séparer les protéines sur la base d'interactions réversibles entre une protéine et un ligand spécifique qui a été couplé à une matrice de chromatographie. Cette technique est extrêmement sélective et procure une grande capacité de purification des protéines. Il est possible d'employer la chromatographie d'affinité dès qu'un ligand adapté est disponible pour la protéine d'intérêt.
La purification par chromatographie d'affinité implique des étapes de capture et d'élution. Dans la phase de capture, la protéine cible est liée de manière spécifique et réversible à un ligand complémentaire qui a été immobilisé sur une matrice de chromatographie. L'objectif est d'isoler, de concentrer et de stabiliser le produit cible, afin de conserver sa puissance et son activité. Après lavage de la matrice pour éliminer la matière non liée, la protéine cible liée est récupérée en modifiant les conditions chromatographiques de façon à faciliter l'élution. L'élution est réalisée de manière spécifique à l'aide d'un ligand compétitif, ou de manière non spécifique en faisant varier le pH, la force ionique ou la polarité. L'élution permet de recueillir la protéine cible sous une forme concentrée et purifiée.
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