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Merck

Development of a novel method for quantification of autophagic protein degradation by AHA labeling.

Autophagy (2014-03-29)
Jianbin Zhang, Jigang Wang, Shukie Ng, Qingsong Lin, Han-Ming Shen
RÉSUMÉ

Autophagy is a catabolic process during which cellular components including protein aggregates and organelles are degraded via a lysosome-dependent process to sustain metabolic homeostasis during nutrient or energy deprivation. Measuring the rate of proteolysis of long-lived proteins is a classical assay for measurement of autophagic flux. However, traditional methods, such as a radioisotope labeling assay, are technically tedious and have low sensitivity. Here, we report a novel method for quantification of long-lived protein degradation based on L-azidohomoalanine (AHA) labeling in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and in human cancer cells. AHA is a surrogate for L-methionine, containing a bio-orthogonalazide moiety. When added to cultured cells, AHA is incorporated into proteins during active protein synthesis. After a click reaction between an azide and an alkyne, the azide-containing proteins can be detected with an alkyne-tagged fluorescent dye, coupled with flow cytometry. Induction of autophagy by starvation or mechanistic target of rapamycin (MTOR) inhibitors was able to induce a significant reduction of the fluorescence intensity, consistent with other autophagic markers. Coincidently, inhibition of autophagy by pharmacological agents or by Atg gene deletion abolished the reduction of the fluorescence intensity. Compared with the classical radioisotope pulse-labeling method, we think that our method is sensitive, quantitative, nonradioactive, and easy to perform, and can be applied to both human and animal cell culture systems.

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Sigma-Aldrich
Méthanol, suitable for HPLC, ≥99.9%
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EN300-247645-50MG50 mg
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Sigma-Aldrich
Sodium Dodecyl Sulfate, BioReagent, suitable for electrophoresis, for molecular biology, ≥98.5% (GC)
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Sigma-Aldrich
Anticorps monoclonal anti-β-actine antibody produced in mouse, clone AC-15, ascites fluid
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EN300-247645-500MG500 mg
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Sigma-Aldrich
Copper(II) sulfate, anhydrous, powder, ≥99.99% trace metals basis
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Anti-LC3B antibody produced in rabbit, ~1 mg/mL, affinity isolated antibody, buffered aqueous solution
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Tris[(1-benzyl-1H-1, 2, 3-triazol-4-yl)methyl]amine, 97%
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Sigma-Aldrich
Anti-p62/SQSTM1 antibody produced in rabbit, ~1 mg/mL, affinity isolated antibody, buffered aqueous solution
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Sigma-Aldrich
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane, ACS reagent, ≥99.8%
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