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Cytochrome c reacts with cholesterol hydroperoxides to produce lipid- and protein-derived radicals.

Biochemistry (2015-04-14)
Thiago C Genaro-Mattos, Raphael F Queiroz, Daniela Cunha, Patricia P Appolinario, Paolo Di Mascio, Iseli L Nantes, Ohara Augusto, Sayuri Miyamoto
RÉSUMÉ

Lipid peroxidation is a well-known process that has been implicated in many diseases. Recent evidence has shown that mitochondrial cholesterol levels are increased under specific conditions, making it an important target for peroxidation inside the mitochondria. Cholesterol peroxidation generates, as primary products, several hydroperoxides (ChOOH), which can react with transition metals and metalloproteins. In this sense, cytochrome c (CYTC), a heme protein largely found in the mitochondria, becomes a candidate to react with ChOOH. Using CYTC associated with SDS micelles to mimic mitochondrial conditions, we show that ChOOH induces dose-dependent CYTC Soret band bleaching, indicating that it is using ChOOH as a substrate. This reaction leads to protein oligomerization, suggesting the formation of a protein radical that, subsequently, recombines, giving dimers, trimers, and tetramers. EPR experiments confirmed the production of carbon-centered radicals from both protein and lipid in the presence of ChOOH. Similar results were obtained with linoleic acid hydroperoxides (LAOOH). In addition, replacing SDS micelles by cardiolipin-containing liposomes as the mitochondrial mimetic led to similar results with either ChOOH or LAOOH. Importantly, kinetic experiments show that CYTC bleaching is faster with ChOOH than with H2O2, suggesting that these hydroperoxides could be relevant substrates for CYTC peroxidase-like activity in biological media. Altogether, these results show that CYTC induces homolytic cleavage of lipid-derived hydroperoxides, producing lipid and protein radicals.

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Sigma-Aldrich
Peroxyde d'hydrogène solution, 30 % (w/w) in H2O, contains stabilizer
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Sigma-Aldrich
Dodécylsulfate de sodium, BioReagent, suitable for electrophoresis, for molecular biology, ≥98.5% (GC)
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Sigma-Aldrich
Cholestérol, Sigma Grade, ≥99%
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Sigma-Aldrich
Dodécylsulfate de sodium, ≥99.0% (GC), dust-free pellets
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Sigma-Aldrich
Phosphate de potassium monobasic, powder, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.0%
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Sigma-Aldrich
Dodécylsulfate de sodium solution, BioUltra, for molecular biology, 10% in H2O
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Sigma-Aldrich
Chlorure de potassium, for molecular biology, ≥99.0%
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Sigma-Aldrich
tert-Butyl hydroperoxide solution, 5.0-6.0 M in decane
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Sigma-Aldrich
Chlorure de potassium, powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%
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Sigma-Aldrich
tert-Butyl hydroperoxide solution, 70 wt. % in H2O
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Sigma-Aldrich
Dodécylsulfate de sodium solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O
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Sigma-Aldrich
Cholestérol, powder, BioReagent, suitable for cell culture, ≥99%
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Sigma-Aldrich
Alcool isopropylique, ≥99.7%, FCC, FG
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Sigma-Aldrich
Chlorure de potassium solution, BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O
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Sigma-Aldrich
Dodécylsulfate de sodium, BioUltra, for molecular biology, ≥99.0% (GC)
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Sigma-Aldrich
Phosphate de potassium monobasic, for molecular biology, ≥98.0%
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Sigma-Aldrich
2-Propanol, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (GC)
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Sigma-Aldrich
Potassium cyanide, BioUltra, ≥98.0% (AT)
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Sigma-Aldrich
Methylene Blue solution, for microscopy, concentrate according to Ehrlich, concentrated, aqueous solution
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Sigma-Aldrich
Phosphate de potassium dibasic, anhydrous, for luminescence, for molecular biology, BioUltra, ≥99.0% (T)
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Sigma-Aldrich
Cholestérol, from sheep wool, ≥92.5% (GC), powder
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Sigma-Aldrich
Chlorure de potassium, BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (AT)
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Sigma-Aldrich
2-Propanol, electronic grade, 99.999% trace metals basis
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Supelco
Dodécylsulfate de sodium, dust-free pellets, suitable for electrophoresis, for molecular biology, ≥99.0% (GC)
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Sigma-Aldrich
Potassium, chunks (in mineral oil), 98% trace metals basis
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Sigma-Aldrich
Potassium hydride, 30 wt % dispersion in mineral oil
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Sigma-Aldrich
Potassium phosphate dibasic solution, 1.0 M
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Sigma-Aldrich
Dodécylsulfate de sodium, ≥98.0% (GC)
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Sigma-Aldrich
Chlorure de potassium, 99.999% trace metals basis
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Sigma-Aldrich
Acétonitrile, anhydrous, 99.8%
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