Vorbereitung von Bibliotheken für NGS

Kits zur Extraktion genomischer DNA

Für die Vorbereitung von DNA-Bibliotheken muss genomische DNA (gDNA) mit hohem Molekulargewicht aus Zellen, Geweben oder anderen Probenarten extrahiert werden. Aufgereinigte genomische DNA soll nur minimale Scherkräfte sowie biologische und chemische Verunreinigungen aufweisen, damit eine optimale Leistung bei nachfolgenden Amplifikations- oder Sequenzierungsreaktionen sichergestellt ist.  

Das Fire Monkey™/Fire Flower™ Kit für die Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht ermöglicht die Isolierung hochreiner genomischer DNA mit minimaler Scherung und niedrigem Molekulargewicht der Nukleinsäurekontaminanten.

• Fire Monkey™ ist ein Standard-Spinsäulen-Verfahren, durch das DNA mit hohem Molekulargewicht und durchschnittlichen Stranglängen von > 100 kb in einer Stunde aus Bakterien- oder Säugerzellen extrahiert wird.
• Fire Flower™ ist ein Standard-Spinsäulen-Verfahren, mit dem innerhalb von 15 Minuten eine Größenauswahl der extrahierten DNA aus jeder Probenquelle vorgenommen werden kann. Mit Fire Flower™ kann die Gesamtstranglänge um 30 % erhöht und dabei DNA-Fragmente bis zu 30 kb depletiert werden. 

Kits für die Ganzgenom-Amplifikation

Die DNA-Sequenzanalyse ist häufig durch geringe Mengen verfügbarer Proben oder eine geringe Extraktionsausbeute eingeschränkt. Wenn nur begrenzt Ausgangsmaterial zur Verfügung steht, können Amplifikationsverfahren eingesetzt werden, um die Menge der Ausgangs-DNA zu erhöhen. Die Ganzgenom-Amplifikation (WGA) kann zur Voramplifikation sowohl intakter als auch stark fragmentierter DNA-Proben zum Einsatz in NGS-Workflows verwendet werden.

Das SeqPlex-I WGA-Kit ermöglicht die Amplifikation kleiner DNA-Mengen oder degradierter bzw. stark fragmentierter DNA für die direkte Eingabe in Illumina® Next Generation Sequencing- (NGS)-Durchflusszellen.  

• Ermöglicht die Sequenzierung schon ab einer Menge von 100 pg DNA
• Verbesserte Primer für vollständige Genomabdeckung, minimale Sequenzverzerrung und ideale Amplikongröße für das Next Generation Sequencing (NGS)
• Kostengünstig: Kein zusätzlicher Schritt für die NGS-Bibliotheksvorbereitung
• Kompatibel mit Illumina^® Next Generation Sequencing

Das erweiterte SeqPlex DNA-Amplifikationskit für die Ganzgenom-Amplifikation wurde entwickelt, um das Next Generation Sequencing aus extrem kleinen Mengen oder aus degradierter/stark fragmentierter DNA zu erleichtern. Dieses Kit wurde für die Integration in Illumina^®, SOLiD™ oder 454-Sequenzierungs-Workflows entwickelt.

• Mit der Zufalls-Priming-Technologie wird fragmentierte DNA wie ChIP oder FFPE amplifiziert
• Vereinfacht die Sequenzierung von Mengen ab 100 pg ChIP-DNA
• Verbesserte Primer für vollständige Genomabdeckung, minimale Sequenzverzerrung und Primerentfernung
• Kompatibel mit Illumina^®, SOLiD™ oder 454-Bibliothekserstellung für das Next Generation Sequencing

Kits für die Amplifikation des Ganztranskriptoms

Das Hauptziel bei der Erstellung einer NGS-Bibliothek für RNA-Seq besteht darin, die Komplexität der Transkriptom-Bibliothek zu maximieren, um den Ausgangspool an Sequenzen vollständig zu repräsentieren und gleichzeitig Verzerrungen zu reduzieren. RNA-Seq für die Erstellung von Genexpressionsprofilen und Transkriptomanalysen mit hohem Durchsatz wird in der Regel durch geringe Mengen an Ausgangs-RNA erschwert. Die Ganztranskriptom-Amplifikation (WTA) kann eingesetzt werden, um ausreichende Mengen an Sequenzierungszielen aus kleinen RNA-Mengen zu generieren, erfordert jedoch eine hochgradig zuverlässige Transkriptreplikation ohne Verlust oder Deformation spezifischer mRNA, damit eine Verzerrung der Bibliothek vermieden wird.

Das SeqPlex-I WTA-Kit ermöglicht die Amplifikation kleiner Mengen revers transkribierter RNA oder degradierter RNA für die direkte Eingabe in Illumina® Next Generation Sequencing- (NGS)-Durchflusszellen. 

• Amplifiziert fragmentierte oder extrem kleine Mengen an Gesamt-RNA. Fragmentierte oder intakte RNA aus allen Quellen, einschließlich FFPE und RIP, lassen sich mit der Zufalls-Priming-Technologie leicht amplifizieren.
• Semi-degeneriertes Primerdesign für die Bibliothek gewährleistet eine vollständigere Abdeckung des Transkriptoms und effizientes Priming
• Weniger Arbeitsschritte: cDNA muss vor der Sequenzierung nicht fragmentiert werden
• Hocheffizient: Amplifiziert ds-cDNA in 8 Stunden oder weniger
• Kostengünstig: Kein weiterer NGS-Bibliotheksvorbereitungsschritt mehr erforderlich
• Kompatibel mit Illumina^® Next Generation Sequencing

Das SeqPlex RNA-Amplifikationskit für die Amplifikation des Ganztranskriptoms (WTA) wurde entwickelt, um das Next Generation Sequencing (NGS) aus kleinen Mengen oder aus degradierter/hoch fragmentierter RNA (z. B. RNA aus Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeproben) zu erleichtern. Das SeqPlex-Kit ermöglicht es dem Benutzer, RNA-Proben für die Eingabe in einen NGS-Workflow vorzuamplifizieren.

• Mit der Zufalls-Priming-Technologie werden geringe Mengen an fragmentierter oder intakter RNA aus allen Quellen, einschließlich FFPE und RIP, amplifiziert
• Semi-degeneratives Bibliotheken-Primerdesign für eine vollständigere Transkriptomabdeckung und effizientes Priming
• Die DNA muss vor der Sequenzierung nicht fragmentiert werden.
• Amplifiziert ds-cDNA in 8 Stunden oder weniger
• Kompatibel mit allen Plattformen des Next Generation Sequencing mit der Ausnahme von Pacific Bioscience

Erstellung von Small-RNA-Bibliotheken

NGS-Technologien haben die Untersuchung kleiner RNA-Moleküle (small RNA) wie miRNA, siRNA und piRNA revolutioniert, die nachweislich eine wichtige Rolle bei der posttranslationalen Regulierung der Genexpression spielen. Die Sequenzierung kleiner RNA erfreut sich zunehmender Beliebtheit als Ansatz für die Entdeckung und Profilierung kleiner RNA. Allerdings können die Methoden zur Erstellung von Bibliotheken kleiner RNA zu erheblichen Verzerrungen führen, insbesondere beim Durchlaufen der Schritte zur Adapter-Ligation. 

Das RealSeq^® AC RNA-Kit für die Bibliothekserstellung bietet eine neuartige Methode zur Erstellung von Bibliotheken für die Sequenzierung von miRNA und kleiner RNA, welche die Verzerrung der Inkorporation beim NGS reduziert. Durch die Verwendung eines neuartigen Einzeladapters und der Zirkularisierung werden durch RealSeq^® die Verzerrungen bei der Bibliotheksvorbereitung erheblich reduziert. Durch diese Technologie wird das Problem der üblicherweise verwendeten Vorbereitungsschritte von Sequenzierungsbibliotheken, die zu einem zu geringen Nachweis vieler miRNA führen, gelöst.

• Erhebliche Verringerung der Sequenzierungsverzerrung bei der Sequenzierung kleiner RNA
• Genaue Quantifizierung biologisch relevanter kleiner RNA
• Ermöglicht eine effizientere Entdeckung neuer kleiner RNA

Cleanup von Bibliotheken

Das Cleanup von NGS-Bibliotheken umfasst die Entfernung von Sequenzieradaptern, PCR-Primern, dNTP, Enzymen und Pufferverunreinigungen und ermöglicht gleichzeitig die Auswahl von Nukleinsäuren, die sich im richtigen Größenbereich für die nachgeschaltete Sequenzierung befinden. Durch die Methoden zur Bereinigung der Bibliothek sollen die Ausbeute und Wiederfindung maximiert, das Vorhandensein biologischer und chemischer Verunreinigungen minimiert und unerwünschte Nukleinsäurefragmente oder Bibliotheksmoleküle in Vorbereitung auf die Sequenzierung entfernt werden.

Das HighPrep™-PCR-Aufreinigungssystem ist ein auf paramagnetischen Beads basierendes Post-PCR-Aufreinigungsreagenz, das für die effiziente Aufreinigung von DNA-Fragmenten und die größenspezifische Auswahl von Amplikons entwickelt wurde. Bei der Aufreinigung werden Salze, Primer, Primer-Dimere und dNTP entfernt, indem die DNA-Fragmente selektiv an die magnetischen Beadpartikel gebunden werden. Die magnetischen Beads werden für verschiedene Chemien zur NGS-Bibliotheksvorbereitung verwendet.

• Hohe Wiederfindung von Amplikons > 100 bp
• Anpassbar an Flüssigkeitsverarbeitungssysteme mit hohem Durchsatz
• Stabile Rückgewinnung von Amplikons > 100 bp, vorhersehbare und konsistente Größenauswahl
• Kein Zentrifugieren und kein Filtrieren führt zu höheren und reineren Ausbeuten