Auto2D^® 자동 2D 겔 전기영동 기기

2D 겔 전기영동은 어떻게 작동합니까? SDS-PAGE 같은 1차원 단백질 겔 전기영동법 기술은 실험실에서 일상적으로 수행되며, 이러한 방법은 분리능이 낮습니다. 2차원 겔 전기영동법(2-DE)은 복합체 시료에서 단백질을 등전점(pI) 값 및 분자량으로 분리하며, 수백 개 또는 수천 개에 이르는 단백질을 높은 해상도로 직접 비교할 수 있습니다. 분석 소프트웨어, 면역검출 또는 질량분석법과 병행하면, 2-DE는 단백질 식별 및 기타 단백질체 분석을 돕는 강력한 도구가 됩니다. 추가적인 자료 및 제품을 보려면, 단백질 전기영동 및 웨스턴 블로팅 페이지를 방문하십시오.

• 완전 자동화 2D 겔 전기영동법
• Auto2D^® 2D 전기영동 기기로 2D 겔을 어떻게 실행하십니까?
• 2D 겔 전기영동을 왜 사용할까요?
• 식품 알레르기 응용분야를 위한 Auto2D^® 2D 겔 전기영동법
• ELISA 및 기타 면역분석용 항HCP 항체 밸리데이션을 위한 Auto2D^® 시스템
• 항원 프로파일링을 위한 Auto2D^® 시스템

완전 자동화 2D 겔 전기영동법

2차원 겔 전기영동은 일반적으로 수행하기 어렵고 시간 소모적으로 여겨지며, 고급 사용자 교육이 필요할 뿐만 아니라 재현성이 낮고 작업자 간 실험 결과의 변동성이 높습니다. Auto2D^® 시스템은 2차원 겔 전기영동을 완전 자동화합니다. 적용된 시료는 1차원 겔에 확산에 의해 흡수되며, 단백질을 등전점에 따라 분리합니다. 평형화를 완료한 1차원 겔은 단백질의 분자량에 따라 분리되는 수평으로 놓인 SDS-PAGE 겔 위에 배치됩니다. Auto2D^® 2D 전기영동 기기는 사용자 친화적이며, 2차원 전기영동이 1~2시간 만에 더 빠르면서도 더 재현성 있는 결과를 낼 수 있도록 합니다. Auto2D^® 2D 전기영동 기기의 추가적인 특징 및 이점은 다음을 포함합니다.

• 사용하기 쉽고, 고급 교육이 필요 없음
• 빠른 워크플로 구현으로 실험 중지 시간 감소
• 작업자 간 변동성을 낮추고 재현성은 높임
• GMP 준수를 위한 IQ/OQ 지원

Auto2D^® 2D 전기영동 기기로 2D 겔을 어떻게 실행하십니까?

Auto2D^® 2D 전기영동 기기는 2차원 겔 전기영동법을 완전히 자동화하고, 단백질 분석을 간소화하며, 일관성과 재현성이 더 높으면서 사용자에 의존하지 않는 결과를 제공합니다. Auto2D^® 시스템의 효율적인 엔지니어링은 시료 로딩, 등전점 전기영동, 평형화, SDS-PAGE 등 일련의 과정에 소요되는 시간을 4~24시간에서 불과 1~2시간까지 크게 줄여줍니다. 이는 Auto2D^® 기기가 시중의 다른 반자동 2DE 시스템과 차별화되는 장점입니다.

그림 1. Auto2D® 기기에 의해 자동화된 2차원 겔 전기영동 워크플로 및 단계.

2D 겔 전기영동을 왜 사용할까요?

Auto2D^® 2D 전기영동 기기는 수많은 분야에서 입증되었습니다. 적합한 사용 사례로는 암 연구에서의 차등단백질발현 분석 및 질병기전의 해명이 있습니다. 또한 결정화 또는 번역 후 변형(PTM) 분석을 위해 정제 단백질을 분리할 때 사용하거나, 알레르기 연구 또는 세포 신호전달경로 분석 같은 연구 분야에서도 2D 웨스턴 블로팅을 위해 사용할 수 있습니다.

그림 2. 왼쪽: 암 생체표지자 연구를 위해 배양된 세포에서 차등 단백질 발현 분석. 녹색은 정상 세포에서의 더 과다한 단백질을 나타냅니다. 빨간색은 암 특이적 단백질 부분을 나타냅니다. 노란색은 단백질 발현에서의 중복을 나타냅니다. 오른쪽: 혈장 시료에서의 차등 단백질 발현.

그림 3. 왼쪽: 치료용 항체 완제의약품에서의 미세한 이질성 평가. 빨간 삼각형은 표적 항체 부분을 나타냅니다. 아래쪽 부분은 항체가 없는 부위입니다. 오른쪽: 정제 전/후 단백질 분석. 2-DE는 결정화 및 X-선 구조 분석을 위해 시료가 균질한 지 여부를 확인하는 용도로 사용할 수 있습니다.

그림 4. SDS-PAGE로 분석한 밀 추출 단백질(SYPRO Ruby로 검출) (A), WB: SDS-PAGE로 분석한 항글리아딘 항체 (B), SDS-PAGE로 병합 (C). 밀 추출 단백질(SYPRO Ruby로 검출), 화살표는 항글리아딘 항체로 검출된 부분을 나타냅니다(D). 항글리아딘 항체를 사용한 WB (E), 병합 (F).

식품 알레르기 응용분야를 위한 Auto2D^® 2D 겔 전기영동법

전 세계에서 알레르기로 고통받는 사람이 매우 많으며 계속 늘고 있다는 점을 감안할 때, 특히 식품 재료에서 알레르기항원을 검출하고 식별하는 일이 점점 더 중요해지고 있습니다. 2차원 겔 전기영동법(2DE)은 전통적으로 알레르기항원성 단백질의 면역검출에 필수인 고분해능 단백질 분리 작업에서 사용되었습니다. 그러나 이 전통적인 분리 공정은 시간이 오래 걸리는 경우가 많은데다 기술적으로 까다롭습니다. Merck Auto2D^® 시스템을 사용하면 완전히 자동화된 2D 전기영동법으로 1~2시간 만에 빠르면서도 신뢰할 만한 결과를 얻을 수 있습니다. 본 문서에서는 당사의 Auto2D^® 시스템이 여러 가지 다양한 재료에서 알레르기항원성 단백질을 찾아내는 작업에 적합하다는 것을 확인하실 수 있습니다.

알레르기는 전 세계적으로 흔한 건강 문제입니다. 알레르기항원의 3가지 주요 근원으로는 식품(세계 인구의 4%에 영향을 미치는 것으로 추정됨), 의약품(세계 인구의 10%로 추정됨), 식물 꽃가루(세계 인구의 10~30%로 추정되며 계속 증가하고 있음)가 있습니다^1-3. 알레르기 반응은 IgE 매개 면역 반응을 통해 일어나며, 전통적으로 피부 단자(찌르기) 검사를 통해 검사해 왔습니다. 하지만 분자를 이용한 방법으로도 알레르기항원 검사 및 진단을 할 수 있습니다¹. 특이 항원에 대해 IgE를 검출하고 식별할 때 사용하는 2가지 분석법이 바로 방사알레르기항원흡착검사(radioallergosorbent test, RAST)와 효소결합면역흡착측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)입니다. RAST 및 ELISA에는 단백질 분리 단계가 포함되지 않습니다. 이 때문에 경우에 따라서는 항체와 식품 기질 성분 간의 교차반응성이 위양성(false-positive) 결과를 초래할 수도 있습니다¹. 

겔 전기영동법은 일반적이면서 널리 사용되는 단백질 분리 분석법입니다. 표준 1차원 겔 전기영동법이 분자량을 기준으로 단백질을 분리하는 반면, 2차원 겔 전기영동법은 등전점(pI)을 기준으로 단백질을 분리하여 분해능을 높입니다. 이처럼 분해능이 증가하면 연구진이 분자량이 서로 근접한 단백질들을(특히 알레르기항원성이 서로 다를 수 있는 아이소폼들의 경우) 구별할 수 있게 됩니다. 또한 2D 겔 전기영동법은 기술적 변동성이 낮다는 점에서 인체의 건강에 영향을 미치는 연구(예: 알레르기항원 식별)에 적합한 방법이기도 합니다⁴.

식품 알레르기 면역검출을 위한 2D 겔 전기영동법

2D 겔 전기영동법과 이후의 면역검출은 다양한 근원에서 발생하는 여러 종류의 알레르기항원성 단백질을 찾아내기 위해 사용되고 있습니다. 식물 꽃가루 연구진은 이 기법을 이용하여 적참나무(red oak) 꽃가루에서 새로운 IgE 결합 단백질을 식별해 냈을 뿐만 아니라, 천연 잔디 추출물에 함유된 임상적으로 관련 있는 알레르기항원들(한 알레르기항원성 단백질의 여러 아이소폼 포함)을 확인하기도 했습니다^5,6. 과거에는 2D 겔 전기영동법을 이용하여 땅콩의 주요 알레르기항원군에 대한 심층 연구(다양한 땅콩 세포주를 비교함)가 진행되었으며, 최근에도 이 기법을 이용하여 천연 콩(대두)의 알레르기항원과 유전자 변형 콩(대두)의 알레르기항원 간에 차이가 없다는 사실이 확인된 바 있다^7,8.

본 문서에서는 4가지 식품 재료, 즉 식물 3가지(콩, 호두, 메밀)와 동물성 재료 1가지(연어알)로부터 알레르기항원을 검출하는 과정에서 나타나는 Auto2D^® 겔 전기영동법의 유용성을 살펴보겠습니다. 이외에도 Merck 시스템은 환자의 혈청을 이용한 면역검출 이후에 특이 알레르기항원을 찾아낼 때 성공적으로 사용되었습니다. 당사는 Auto2D^® 시스템을 이용하여 SDS-PAGE의 단일 밴드를 콩 시료 및 연어알 시료의 알려진 주요 알레르기항원에 상응하는 여러 개의 개별 단백질 스폿으로 분해했습니다. 이러한 결과에 따르면, 알레르기항원 식별 작업에 Auto2D^® 겔 전기영동 시스템을 사용함으로써 시간과 필수 기술 전문지식 양자를 절감시키면서도 신뢰 가능한 고품질의 결과를 계속 얻을 수 있습니다.

식품 알레르기 응용분야를 위한 Auto2D^® 2D의 결과

시중에 판매되는 콩(대두) 2.5 g을 증류수 25 mL에 밤새 담가 두었다가 공이로 콩을 찧어 으깬 다음, 으깨진 콩을 천주머니에 넣고 짜내서 콩 추출물을 확보했습니다. 이 물질의 단백질 농도는 두유(약 30 µg/μL)와 비슷했습니다. 그런 다음 Auto2D^® 시스템을 이용하여 시료 30 μg을 분석 대상으로 삼고, 0.5 μL를 기존 SDS-PAGE에 투입했습니다. Auto2D^® 시스템을 이용한 2DE 과정에서는 IEF 칩 pH3-10NL을 1번 차원으로, PAGE 칩 12.5%를 2번 차원으로 선택했습니다. 이 시료는 표준 프로그램(pH3-10NL M)을 사용하여 실행되었습니다. 전기영동법이 완료된 후 1D SDS-PAGE 및 Auto2D^® 젤의 단백질이 Coomassie Brilliant Blue(CBB) 염색법으로 염색되었습니다. Auto2D® 기기로 별도의 시료를 실행한 후, 반건식 블로팅을 통해 해당 시료를 Immobilon^® P 블로팅 멤브레인으로 전달했습니다. 면역검출 과정에서 블로팅 멤브레인은 PBS-T 내 5% NFDM으로 차단되었습니다. 차단 이후에는 콩 알레르기 환자 혈청(International Bioscience, Inc.)을 차단 용액으로 20배 희석한 후, 해당 멤브레인에 첨가하여 부드럽게 교반시키면서 배양했습니다. 이 멤브레인은 PBS-T로 세척된 후 차단 용액으로 희석된 HRP 접합 2차 항체에 반응했고, 이어서 표준 화학발광 검출을 실시했습니다. 

그림 5. 콩 추출물의 2DE 분리 및 환자 혈청을 이용한 면역검출. 콩 단백질 추출물은 SDS-PAGE(A: 15 ug) 및 Auto2D^® 시스템(B, C: 30 ug)으로 분리되었으며, 이 과정에서 IEF 칩: pH3-10NL, PAGE 칩: 12.5% 및 Tris-Glycine 시약 키트가 사용되었습니다. 겔에 함유된 전단백질은 CBB(A-1, B)로 염색되었습니다. 콩 알레르기 환자 혈청(A-2, C)을 사용하여 면역검출을 실시했습니다. SDS-PAGE의 주요 밴드에 상응하며 Gly m 6으로 간주된 스폿의 경우, 18kDa(빨간색 화살표) 주변에서 콩 알레르기항원의 주요 성분 한 가지가 검출되었습니다.

각 추가 항원 시료는 다음과 같은 각각의 조건에 따라 준비했습니다. 메밀가루는 디에틸에테르로 탈지하고 코카 버퍼(85 mM NaCl, 32.7 mM NaHCO₃, 42.5 mM 페놀)로 처리한 다음 PBS로 투석했습니다. 1번 D IEF 공정에 영향을 미칠 수 있는 염분 및 이온 불순물을 제거하기 위해 단백질 침전 키트(ProteoExtract^® 키트)를 사용하여 메밀 추출물을 추가 가공했습니다. 막자사발로 호두를 찧어 으깨고 포유류 세포 용해 키트(MCL1, Sigma)를 사용하여 단백질 추출을 실시했습니다. 연어알 조직은 1 M의 KCl-PBS에서 균질화되었습니다. 겔 여과 스핀 컬럼을 이용하여 호두 추출물과 연어알 추출물을 탈염했습니다. 탈염 방법에 따라 단백질 시료를 재수화 용액(8 M 요소, 2 M 티오요소, 4% CHAPS, 50 mM DTT, 0.02% 양성전해질)에 넣어 용해시키거나 해당 용액과 교환했습니다.

BCA 또는 Bradford 단백질 분석을 이용하여 준비된 각 시료에 대해 단백질 계량을 실시했습니다. 사전 설치된 표준 Auto2D^® 프로그램(“pH3-10NL M” 처방전) 또는 기존 SDS-PAGE를 이용하여 단백질 분리를 실시했습니다. 가장 넓은 분리 가능 범위를 다루기 위해 IEF 칩 pH3-10NL 및 PAGE 칩 12.5%를 1번 D 및 2번 D 겔 칩으로 선택했습니다. 전기영동법이 완료된 후 Auto2D^® 젤의 분리된 단백질이 Coomassie ReadyBlue™ 염색법 또는 SYPRO^® Ruby Gel 염색법으로 염색되었습니다. 별도로 준비된 면역검출용 Auto2D^® 젤은 해당 칩에서 제거된 후 습식 전달 기기(KS8452, Oriental 기기)를 이용하여 Immobilon® P 블로팅 멤브레인으로 전달되었습니다. 단백질을 전달받은 PVDF 멤브레인은 PBS 내 SuperBlock™ 차단용 버퍼로 1시간 동안 차단되었습니다. 환자 혈청은 0.1% BRIJ가 함유된 PBS를 이용해 30배 희석되었으며, 그 결과 밤새도록 4 °C에서 흔드는 동안에도 이 멤브레인에 반응할 수 있었습니다. 상기 희석용 버퍼로 해당 멤브레인을 세척한 후, 2,000배 희석한 알칼리 인산분해효소(AP) 접합 항인간 IgE Ab(SeraCare)를 2차 Ab로 적용하고 실온에서 3시간 동안 배양했습니다. 세척이 끝난 후 이 멤브레인은 AP 반응 버퍼(100 mM NaCl 및 5 mM MgCl₂이 함유된 100 mM Tris-HCl 버퍼 pH 9.5)에서 평형화되었으며, 표적 단백질 발색 검출용 BCIP/NBT 기질(SeraCare)의 1개 성분 유형에 반응했습니다.

그림 6. 호두 단백질 추출물의 2DE 분리 및 알레르기 환자 혈청을 이용한 면역검출. 호두 단백질 추출물은 겔 여과 스핀 컬럼에서 탈염되고 재수화 용액으로 평형화된 후에 SDS-PAGE(A) 및 Auto2D^® 시스템(B, C, D: 10 ug)으로 분리되었으며, 이 과정에서 IEF 칩: pH3-10NL, PAGE 칩: 12.5% 및 Tris-Glycine 시약 키트가 사용되었습니다. 호두 추출물에 함유된 전단백질은 멤브레인을 대상으로 한 아미도 블랙 기법(A), SYPRO^® Ruby gel 염색법(B), 환자 혈청을 이용한 면역검출(C), 음성 대조군인 비알레르기 혈청(D)을 통해 시각화되었습니다.

그림 7. 메밀 알레르기 환자 혈청을 이용한 면역검출. 메밀 단백질 추출물은 ProteoExtract^® 침전 키트로 처리되고 재수화 용액으로 용해된 후에 SDS-PAGE(A) 및 Auto2D^® 시스템(B, C, D: 10 ug)으로 분리되었으며, 이 과정에서 IEF 칩: pH3-10NL, PAGE 칩: 12.5% 및 Tris-Glycine 시약 키트가 사용되었습니다. 메밀 추출물에 함유된 전단백질은 멤브레인을 대상으로 한 아미도 블랙(Amido Black) 기법(A-1) 또는 겔에 함유된 SYPRO^® Ruby 시약(B)을 통해 시각화되었습니다. 환자 혈청(A-2 및 C) 및 음성 대조군인 비알레르기 혈청(A-3 및 D)을 이용한 면역검출.

그림 8. 연어알 알레르기 환자 혈청 조사를 통한 알레르기 성분 분리 및 면역검출. 연어알 단백질 추출물은 겔 여과 스핀 컬럼에서 탈염되고 재수화 용액으로 평형화된 후에 SDS-PAGE(A) 및 Auto2D^® 시스템(B, C, D)으로 분리되었으며, 이 과정에서 IEF 칩: pH3-10NL, PAGE 칩: 12.5% 및 Tris-Glycine 시약 키트가 사용되었습니다. 연어알 추출물에 함유된 전단백질은 멤브레인을 대상으로 한 아미도 블랙(Amido Black) 기법(A-1) 또는 겔에 함유된 ReadyBlueTM CBB 염색용 시약(B, 35 ug)을 통해 시각화되었습니다. 환자 혈청(A-2 및 C, 10 ug) 및 음성 대조군인 비알레르기 혈청(A-3 및 D: 10 ug)을 이용한 면역검출. 15~20 kDa 주변의 스폿(빨간색 화살표)은 연어알 β’ 성분의 주요 알레르기항원으로 간주됩니다. 연어알 β’ 성분은 2개의 소단위로 이루어진 35 kDa 비텔로제닌 조각입니다.

알레르기 혈청의 IgE에 반응한 단백질 스폿을 식별하기 위해 웨스턴 블롯 영상을 총 단백질 검출량과 비교했습니다. 알레르기항원성 성분을 찾아내기 위해서는 일반적으로 중첩된 스폿을 겔에서 잘라내고, 겔 내부에서 효소를 통해 펩티드 조각으로 소화시키고, 소화된 조각을 질량분광분석법으로 분석합니다.   2DE는 1DE에서 단일 밴드로 나타났던 여러 단백질의 존재를 보여줌으로써 더 우수한 분해능을 입증할 수 있었습니다. 이러한 자료에 따르면 2D 면역검출에서는 알레르기 혈청을 이용하여 보다 적은 단계로 IgE 반응 단백질을 분리하고 식별할 수 있으며, 이로써 질량분광분석법으로 원인 분자를 찾아내는 것이 더욱 쉬워집니다.

식품 알레르기 응용분야를 위한 Auto2D^® 2D의 설명

2차원 겔 전기영동법은 알레르기항원성 단백질의 검출 및 식별 작업에서 일반적으로 사용되는 단백질 분리 기법입니다. Auto2D^® 시스템은 이 기법으로 고품질 결과를 얻는 데 필요한 시간과 기술 전문지식을 절감하기 위해 설계되었습니다. 본 문서에서는 Auto2D^® 시스템이 4가지 식품 재료로 만들어진 단백질 시료에서 알레르기항원을 검출함으로써 나타나는 알레르기 연구에서의 유용성을 확인해 보겠습니다. 이외에도 1차원 SDS-PAGE의 단일 밴드로부터 채취한 콩 시료 및 연어알 시료 각각의 알려진 주요 알레르기항원을 Auto2D^® 시스템을 이용하여 여러 개의 개별 스폿으로 분해할 수 있었습니다. 콩 시료에서는 알려진 주요 알레르기항원성 단백질 9인 Gly m 6(글리시닌)의 기본 소단위에 상응하는 18 kDa 밴드로부터 3개 스폿을 분해했습니다. 연어알 시료에서는 마찬가지로 알려진 주요 알레르기항원성 단백질 10인 β’ 성분(비텔로제닌)의 2개 소단위에 상응하는 16~18 kDa 밴드로부터 여러 개의 스폿을 분해했습니다. 전반적으로, 이러한 결과는 알레르기항원 면역검출 과정에서 Auto2D^® 시스템을 기존 2D 겔 전기영동법의 신속하고 신뢰할 만한 대안으로서 효과적으로 사용할 수 있다는 점을 시사합니다.

감사의 말:

콩 자료를 제공해 주신 모리야마 타츠야 교수님(일본 긴키대학교 농학부), 그리고 호두/메밀/연어알 자료를 제공해 주신 곤도 야스토 교수님(일본 후지타의과대학 반탄병원)께 진심으로 감사드립니다.

바이오의약품에서 잔류 HCP 측정

2D 겔 전기영동은 치료용 단백질 분석 및 항체 바이오공정에서 오염된 숙주세포단백질(HCP) 분석에도 적합합니다. 생물제제 제조 공정에서 유입된 잔류 HCP 불순물은 환자에게 면역원성 반응을 유발하고 약물 효능을 감소시킬 수 있습니다. 규정을 준수하려면 안전성을 보장하기 위해 허용 가능한 수준으로 HCP를 모니터링하고 제거하는 것을 필요로 합니다. 일본, 유럽, 미국 약전에서는 바이오의약품 제품 제조를 위해 HCP 분석의 개발 및 검증을 위한 지침을 발표하였습니다.

규정 준수를 충족하기 위해 HCP 분석은 모든 분석 성분의 철저한 적격성 평가와 함께 체계적으로 개발되어야 합니다. 항체 검증에 있어서, 포괄적인 HCP 적용범위를 보장하기 위해 2차원 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(2D-PAGE)이 필요합니다. 2D-PAGE를 포함한 겔 전기영동은 다클론항체 제품을 위한 교정 표준 또는 면역원으로서 사용되는 항원의 특성화에도 권장됩니다. Auto2D^® 2D 전기영동 기기는 고급 사용자 교육이 필요 없으며, 바이오공정 워크플로에서 실행을 용이하게 하여 산업 표준 준수를 충족시킵니다.

ELISA 및 기타 면역분석용 Anti-HCP 항체 검증을 위한 Auto2D^® 시스템

ELISA는 HCP 분석을 위한 가장 일반적인 분석 포맷입니다. 이 면역분석법은 잔류 HCP를 광범위하게 인식하는 다클론항체를 필요로 합니다. 일본 및 유럽 약전은 HCP 항체 적용범위를 평가하기 위해 2D 겔 전기영동 후에 웨스턴 블로팅 분석(2D 웨스턴 블로팅)의 사용을 명시하고 있습니다. 미국 약전은 항체 적용범위를 평가하기 위해 2D 웨스턴 블로팅 분석 또는 면역친화 정제 후에 겔 전기영동의 사용을 명시하고 있습니다.

그림 9. 상업적 공급원에서 얻은 Cy3 표지된 CHO HCP 항원 20 μg을 pH 3~10 IEF 칩 및 12.5% PAGE 칩을 사용하여 Auto2D^® 시스템 상의 2D 겔 전기영동으로 분리하였습니다(A). 이후 단백질을 멤브레인으로 옮기고, 2개의 각기 다른 anti-HCP 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅으로 분석하였습니다(B, C). 데이터는 anti-HCP 항체 1이 anti-HCP 항체 2에 비해 숙주 세포 단백질의 적용범위가 더 넓은 것을 나타냅니다.

Auto2D^® 시스템의 높은 재현성

일관되고 재현성 있는 공정은 생물제제 제조 및 품질관리에 필수적입니다. 더 빠른 결과 및 더 높은 처리량과 더불어, 완전 자동 Auto2D^® 겔 전기영동 시스템은 2D-PAGE 및 2D-DIGE 방법에서 일별 변동성 및 작업자 간 변동성을 제거하며, 더 신뢰성 있는 결과를 위해 유의미하게 향상된 재현성을 제공합니다.

그림 10. 상업적 공급원에서 얻은 Cy5 표지된 CHO HCP 항원 0.75 μg을 2D 겔 전기영동으로 분리하고, IEF 칩 pH 3~10NL 및 12.5% PAGE 칩을 사용하여 Auto2D^® 시스템에서 분석하였습니다. 동일한 시료가 총 3회 측정되었습니다(A~C). 하얀 부분(D)은 결과의 중첩을 보여줍니다. 데이터는 Auto2D^® 시스템을 이용한 2차원 겔 전기영동의 높은 재현성을 시사합니다.

항원 프로파일링을 위한 Auto2D^® 시스템

ELISA 및 기타 면역분석용 다클론항체 풀을 획득하기 위해서는 HCP 항원을 이용한 면역화가 필요합니다. HCP 항원은 검출 및 계량을 위한 교정 표준으로서도 사용됩니다. 공정 특이적 HCP 항원은 형질주입되지 않은 무표지 세포 배양으로부터 만들어집니다. 이러한 항원은 HCP의 패턴을 보이고, 광범위한 단백질 존재를 확인하도록 특성화되어야 하며, 무표지 세포 배양으로부터 얻은 HCP 항원이 생산 배양에서 얻은 항원을 대표할 수 있어야 합니다. 일본, 유럽, 미국 약전은 항원 특성화 및 프로파일링을 할 때 SDS-PAGE 또는 2D 겔 전기영동의 사용을 권장합니다. 또한 미국 약전은 잔류 HCP 모니터링을 상호 보완하는 방법으로서 2D 겔 전기영동을 사용하는 것을 제안합니다.

그림 11. Cy3 표지된 비정제 CHO HCP 항원 및 Cy5 표지된 단백질 A로 정제된 CHO HCP 항원의 혼합물은 Auto2D^® 시스템을 사용하여 2차원 차등 겔 전기영동(2D-DIGE)에 의해 분리 및 분석되었습니다(A~B). 병합된 데이터에서 붉은 부분(C)은 단백질 A를 이용한 정제 이후에도 남아있는 숙주세포단백질(HCP)을 나타냅니다. 이 데이터는 정제 후 잔존하는 숙주세포단백질(HCP)의 프로파일링을 위해 Auto2D^® 시스템을 사용할 수 있음을 보여줍니다.

규제 요구 사항 준수를 위한 Auto2D^® 시스템

Auto2D^® 시스템은 바이오의약품 제조에서 HCP 분석을 위한 규제 요건을 준수하도록 지원합니다. 이 완전 자동화 시스템은 일별 변동성 및 작업자 간 변동성을 제거하여, 신뢰성 있는 결과를 얻는 데 2시간도 걸리지 않습니다. 바이오공정 워크플로에서 실행을 용이하게 하는 Auto2D^® 시스템은 생산 변경과 관련된 실험 중지 시간을 감소시킵니다. HCP 분석을 위한 외주가 필요 없고 사내에서 분석을 진행하므로 지적 재산을 보호할 수 있습니다. 추가적인 제품 및 자료를 원하시면 단백질 전기영동 및 웨스턴 블로팅 허브 페이지를 방문하십시오.

참고문헌

1. De Angelis M, Di Cagno R, Minervini F, Rizzello CG, Gobbetti M. 2010. Two‐dimensional electrophoresis and IgE‐mediated food allergy. Electrophoresis. 31(13):2126-2136. https://doi.org/10.1002/elps.201000101

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