(U)HPLC/LC-MS 성능 최적화 시 실행되는 여과의 중요성
HPLC 시료 여과용 Millex® 시린지 필터
이동상/용매 여과용 Millipore® 멤브레인 필터 및 필터 홀더
적절한 시료 전처리 기법이 고품질 자료의 확보에 핵심적인 역할을 한다는 것은 잘 알려져 있는 사실입니다. (U)HPLC/LC-MS 분석 전에 시료 전처리 단계로서의 여과를 건너뛰는 경우도 종종 있습니다. 하지만 이처럼 여과 작업을 생략하면 시료 속 입자의 존재로 인해 예기치 못한 결과가 발생할 수 있고, 이동상 때문에 컬럼과 기기의 성능이 저하될 수도 있습니다. 당사는 Millex® 시린지 필터의 입자 잔류 기능에 대한 조사 결과를 다른 시린지 필터의 결과와 비교했습니다. 비교 결과에 따르면, 입자 잔류 효율(또는 잔류율)은 컬럼의 수명과 상관관계가 있었습니다. 이 비교 과정에서는 여과된 시료와 여과되지 않은 시료를 둘 다 UHPLC 시스템에 주입한 다음 주입이 최대 500회 이루어질 때까지, 혹은 설정된 압력 기준치를 초과할 때까지 역압을 모니터링했습니다. 또한 당사는 이동상 여과가 컬럼의 역압에 미치는 영향을 평가했습니다. 본 자료는 HPLC 컬럼 수명의 최적화 과정에서 실행되는 여과의 중요성을 시사합니다.
UHPLC/HPLC/LC-MS 과정에서 실행되는 여과
고성능/초고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, UHPLC)와 액체 크로마토그래피-질량분광법(LC-MS)은 약물 개발 및 제약 QC, 학계/정부 연구, 식음료 분석, 임상/환경 검사에서 일반적으로 사용되는 분석 방법입니다. 여과는 시료 전처리 기법 중 가장 간편하면서 비용도 가장 저렴한 기법으로, 시료에 포함된 입자를 제거하는 작업입니다.1 입자가 저농도에서도 시료에 용해되지 않으면 HPLC 컬럼이 막혀 기기의 역압이 높아지고 컬럼 수명이 감소하는 동시에 자료의 품질까지 떨어질 가능성이 있습니다.2,3 따라서 여과를 이용해 이 입자를 시료로부터 제거하면 앞서 설명한 문제들을 예방하는 한편, 더 우수한 크로마토그래피 자료를 제시하는 데에도 도움이 될 수 있습니다.4
여과는 (U)HPLC 및 LC-MS에 필요한 이동상을 전처리하는 과정에서도 중요한 역할을 합니다.5,6,7 시중에서 판매되는 HPLC, UHPLC, LC-MS 및 MS 전용 용매는 사전 여과를 거치기 때문에 이들 용매를 병에 담긴 상태 그대로 이동상으로 사용할 때는 추가 여과를 실시할 필요가 없습니다. 다만 상당수의 방법에 따라서는 버퍼 및/또는 혼합물을 이동상으로 사용해야 하므로, 이들 방법을 사용할 때는 염류(예: 인산염, 아세트산염)를 첨가해야 합니다.8 이 경우에는 버퍼를 사용 전에 여과하고9 항상 신선한 상태로 사용하는 것이 좋습니다.8
당사는 다양한 시린지 필터의 잔류 효율을 측정했습니다. 또한 시료 여과 여부에 따른 컬럼 수명에 대해서도 비교를 해 보았습니다.
다양한 시린지 필터의 입자 잔류
잔류는 여과 과정에서 시료로부터 제거되거나 필터를 통과하여 기기로 들어가도록 허용된 입자의 비율을 나타내는 지표입니다. 4개 제조사의 시린지 필터를 사용해서 입자 잔류를 평가했습니다. 이 시린지 필터들은 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 또는 재생 셀룰로오스(RC) 중 하나로 제조되었습니다. 0.05%(v/v) 비드 수용액을 여과한 후에 0.45μm 시린지 필터를 통한 0.5μm 직경 비드 및 0.2μm 시린지 필터를 통한 0.24μm 직경 비드의 잔류율을 측정했습니다. 비드 용액이 로트당 시린지 필터(n=4)를 통과했으며, 대부분의 경우 로트를 여러 개 검사했습니다. 비드 용액 3mL를 여과하고 나서 여과액을 채취한 다음, 이 여과액의 특성을 형광법으로 규명하거나 분광광도법으로 6점 표준 곡선과 비교했습니다.
표 1은 검사를 거친 0.45μm 시린지 필터 4종의 잔류 효율을 나타냅니다. 잔류 효율은 멤브레인 필터 소재에 따라 달라졌습니다. RC 필터에서 최저 잔류율(48.2+/-4.3%)이 확인된 반면, PTFE 시린지 필터의 폴리스티렌 비드에서는 잔류율이 약 98~100%로 나타났습니다.
HPLC를 사용할 때에는 컬럼에 작은 크기의 입자(예: 2µm 미만의 입자 또는 UHPLC)가 들어찬 경우(0.2μm 필터가 필요함)를 제외하고, 0.45µm 필터 멤브레인으로 여과하는 것이 효율적입니다.5,10 UHPLC 컬럼은 입구 프릿, 사이 공간, 튜브 직경 모두 다공성이 낮아서 더 쉽게 막힙니다. 이 때문에 0.2μm 시린지 필터를 통한 0.24μm 직경 비드의 잔류율도 같이 평가했습니다(표 2). RC 필터의 잔류 효율이 20% 미만인 것은 여과 대상 입자 중 80%가 넘는 양이 멤브레인을 통과했다는 것을 의미합니다. 친수성 PTFE 시린지 필터 3종의 잔류 효율은 필터마다 다르게 나타났습니다. 특히 2번 MFR의 값이 전체적으로 가장 낮았으며, 이와 동시에 로트별 비율이 비일관적으로 집계되기도 했습니다.
이 잔류 효율 데이터는 정격 구멍 크기가 똑같은 시린지 필터들이라도 시료 여과 과정에서 전부가 동일하게 작동하지는 않는다는 것을 시사합니다.
시료 여과 여부에 따른 HPLC 컬럼 수명 평가
여과되었거나 여과되지 않은 0.05%(v/v) 비드 용액을 10μL씩 반복 주입하면서 컬럼 수명을 평가했습니다. 이전에 검사를 거친 0.45μm 시린지 필터의 장치(n=30)를 사용해서 HPLC 인증 바이알 30개로 흘러 들어가도록 여과를 실시했습니다. 대부분의 경우 로트를 여러 개 검사했습니다. 매회 주입이 끝난 후에는 컬럼 주입이 최대 500회 이루어질 때까지, 혹은 설정된 압력 기준치(8,000 psi)를 초과할 때까지 역압 변화를 모니터링했습니다. 이 기준치는 시스템의 압력이 위험한 수준에 도달할 일이 생기지 않도록 설정되었습니다. HPLC 조건은
표 3에 나와 있습니다.
모든 0.45μm 시린지 필터에 대한 검사 때마다 새로운 컬럼을 사용했습니다. 직전 실행 시 사용된 모든 입자가 시스템에서 제거되도록 검사 때마다 컬럼이 장착된 경우와 장착되지 않은 경우 모두 튜브, 주입기, 씰, HPLC 시스템 전부를 꼼꼼히 세척했습니다. 새 컬럼을 장착할 때마다 10분 동안 70:30 아세토니트릴:물(1mL/분)로 시스템을 씻어낸 다음, 역압 베이스라인 수치가 안정적으로 확립될 때까지 약 10~15분간 이동상과 평형을 이루도록 맞추었습니다(표 3).
0.45μm 시린지 필터를 사용해서 0.5μm 직경의 폴리스티렌 비드가 들어 있는 0.05%(v/v) 용액을 HPLC 인증 바이알로 여과했습니다. 이어서 이 여과액을 UHPLC 기기에 주입했습니다. 역압 기준치(8,000 psi)에 도달하거나 이 수치를 초과할 때까지 반복 주입을 10μL씩만 실시했습니다. 여과되지 않은 시료도 곧바로 주입했습니다. 결과는 그림 1에 나와 있습니다.
그림 1. 시료 여과가 UHPLC 시스템의 역압에 미치는 영향. 0.5μm 직경의 비드가 들어 있는 여과/비여과 0.05%(v/v) 용액의 주입 횟수를 기준으로 한 평균 역압(psi)을 도표로 나타낸 것입니다. 여과된 시료는 0.45μm 친수성 PTFE 시린지 필터 3종 및 RC 시린지 필터 1종을 거쳤으며, 각 필터의 제조사(MFR)는 서로 다릅니다. 여과되지 않은 용액도 같이 주입했습니다.
역압이 기준치(8,000 psi)를 초과하기 전까지 여과되지 않은 시료를 36회만 주입했습니다. 이 기준치는 RC 시린지 필터 여과액을 71회 주입한 후에 초과되었습니다. 이러한 결과는 입자가 빠른 속도로 컬럼을 틀어막았으며 10μL 주입 한 번만으로도 컬럼 수명이 크게 줄어들었다는 것을 의미합니다. 이 결과와 상관관계가 있는 잔류 효율 자료에서는 RC 시린지 필터를 통과한 용액 속 입자가 전체의 48%에 불과한 것으로 나타났습니다. 다시 말해서, 여과 대상 입자의 약 50%가 UHPLC 시스템으로 대신 주입된 것입니다. PTFE로 여과된 시료의 경우, 컬럼 역압의 뚜렷한 변화가 나타나지 않은 상태에서 모든 양을 500회 넘게 주입할 수 있었습니다. 이는 앞에서 설명한 대로 이 시린지 필터들을 통해 입자가 100% 가까이 잔류했기 때문입니다.
이동상 여과용 멤브레인 필터 평가
(U)HPLC/LC-MS 응용분야를 대상으로 실행되는 여과의 중요성은 시료 여과에만 국한되지 않습니다. 이동상 속 입자의 존재 역시 (U)HPLC 과정에서 심각한 문제를 일으킬 수 있습니다. 과거 Joshi, et. al.이 실시한 한 임상시험에서는 이동상 속의 입자를 불완전하게 제거한 경우에도 UHPLC 컬럼의 역압이 증가하는 결과가 나타났습니다(그림 2).7,11 해당 시험에서는 50:50 아세토니트릴:물로 이루어진 이동상을 폴리프로필렌(PP)/친수성 PTFE 멤브레인 필터(구멍 크기 0.2μm 및 0.45μm)로 여과했습니다. 이동상이 0.25mL/분 유량으로 UHPLC 컬럼까지 계속 흘러가게 둔 후, 600분이 넘도록 역압을 모니터링했습니다.
그림 2. 이동상이 600분 동안 0.25mL/분 유속으로 흘렀을 때 UHPLC 시스템 역압(psi)의 시간(분) 대비 변화. 이 이동상은 0.2μm/0.45μm 폴리프로필렌(PP)/PTFE 멤브레인으로 여과되었습니다. (참고문헌 11번에서 발췌한 후 허가 하에 다시 출력했습니다.)
검사 대상 멤브레인 필터 4종 중에서도 0.45μm/0.2μm 폴리프로필렌 멤브레인으로 여과된 이동상에서 최대 수준의 역압 증가가 나타났습니다. 이동상 속 입자는 앞에서 이미 설명한 것과 동일한 컬럼 문제를 일으킬 뿐만 아니라, 기기 부품(예: 펌프 체크 밸브, 피스톤, 씰)의 조기 고장을 유발할 수도 있습니다.12 용량이 시료 주입 때에 비해 크게 늘어난 이동상이 실험 도중 컬럼에 닿으면(종류에 관계없이 입자가 존재할 경우), 관찰된 컬럼 폐쇄 효과가 더욱 빨리 발생하고 가중될 수 있습니다.
멤브레인 필터의 잔류율에 영향을 미치는 요인
멤브레인 필터(미공성 장벽 역할을 함)를 사용해서 시료 및 이동상 여과를 실시했습니다. 멤브레인의 구멍은 입자의 물리적 크기만한 공간을 팽창성 기질에서 제외시키는 역할을 합니다. 단, 특정 상황에서는 예상보다 크거나 멤브레인의 정격 구멍 크기보다 큰 입자가 해당 멤브레인을 통과할 수 있습니다. 아니면 그러한 크기보다 작은 입자가 멤브레인을 통과하지 못하여 잔류율 결과가 달라질 수도 있습니다.
미세 필터의 구멍이 띠는 여러 가지 특징(예: 모양, 크기, 주파수, 분포, 대칭)에 따라 필터가 특정 크기의 입자를 잔류시키는 방식이 정해집니다. 본 필터 잔류 연구에서는 구멍 크기가 동일한(특히 구멍이 0.2µm인) 여러 제조사의 서로 다른 PTFE 필터에서 같은 입자의 잔류율이 다양하게 나타났습니다. 이는 제조사마다 구멍 크기의 분포와 다공성이 이전보다 넓어졌거나 좁아졌기 때문일 수 있습니다. 다시 말해서, 각 구멍 크기의 최소~최대 범위가 제조사마다 상당히 다를 수 있습니다. 멤브레인 주조 공정은 동일한 재료를 사용하더라도 공급업체마다 다르게 진행됩니다. 따라서 그러한 공정에서 만들어지는 구멍의 모양은 재료마다, 때로는 로트마다 대폭 달라질 수 있습니다. 특히 이 공정을 세심하게 제어하지 않는 경우에 그러합니다. 게다가 제조사들이 다공성과 구멍 크기를 측정하는 방법도 서로 다릅니다. 이러한 방법은 공기 투과도, 포점, 순수 투과도, BET 분석, 다공성 측정 또는 잔류율 등에 대한 검사를 기준으로 정해집니다.
(U)HPLC/LC-MS 시료 전처리 과정에서 시린지 필터를 사용할 때 반드시 고려해야 하는 특성은 입자의 잔류율만이 아닙니다. 멤브레인의 기타 특성(예: 화학적 구조, 화학적 적합성, 필터 직경/두께/하우징)은 물론 여과 대상 용액/분석물 양자의 화학적 특성도 멤브레인 필터의 전반적인 성능에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다.13
여과, 컬럼 폐쇄 및 HPLC 분석
업계에서는 (U)HPLC 분석 전에 시료를 여과하는 것을 우수 관행으로 여깁니다.5 이처럼 시료를 미리 여과하면 컬럼의 조기 폐쇄와 기기 역압의 증가를 방지하고, 나아가 불필요한 시스템 종료와 실험실의 생산성 상실을 예방하는 동시에 자료의 품질을 유지할 수도 있습니다. 잔류 효율 연구의 결과는 (U)HPLC 주입 전에 시린지 필터를 사용해서 입자가 함유된 시료를 여과할 경우, 시린지 필터의 컬럼 보호 방식이 달라질 수 있다는 점을 시사합니다.
시린지 필터들의 정격 구멍 크기가 동일하더라도 입자 잔류 효율은 서로 달라질 수 있습니다. (U)HPLC 컬럼이 조기에 막히지 않게 하기 위해서는 입자를 효율적으로 잔류시키는 필터를 선택해야 합니다. 또한 입자가 컬럼의 폐쇄를 유발할 뿐만 아니라, 시간이 지날수록 기기 부품의 고장을 일으킬 수도 있다는 점에서 이동상 역시 여과해야 합니다. 따라서 HPLC 컬럼의 수명을 보호하고 일관적인 고품질 자료를 생성하기 위해서는 시료/이동상 두 가지를 모두 여과하는 방안을 항상 염두에 두어야 합니다.
참고문헌
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