Ultrafiltration에 의한 바이러스 농축

• 바이러스의 분리, 증식, 특성화
• 바이러스 증식을 위한 일반적인 방법
• 고역가 바이러스 스톡을 위한 바이러스 농축
• Amicon^® Ultra 원심분리 Ultrafiltration 장치를 이용하는 바이러스 농축
• 결론
• 원심분리 Ultrafiltration 장치

바이러스의 분리, 증식, 특성화

그림 1. 바이러스 농축을 위한 Ultrafiltration. 액체는 멤브레인 필터를 투과하지만 큰 바이러스 입자는 잔류합니다.

바이러스 분리 및 증식 방법은 연구, 백신 생산, 진단 워크플로에 매우 중요합니다. 기초 연구 실험실에서는 바이러스 생물학 및 발병 기전을 연구하기 위해 바이러스 스톡을 사용합니다. 백신 생산에는 바이러스의 소규모 및 대규모 준비가 요구됩니다. 대부분의 진단 실험실에서 바이러스 질환 진단을 위해 비배양적 접근법을 사용함에도 불구하고 생육 가능한 분리주가 필요한 경우, 생육 가능하거나 가능하지 않은 바이러스를 분리해야 하는 경우, 비배양 방법보다 배양 기반 방법이 더 빠른 결과를 제공하는 경우에는 여전히 세포 배양 내 바이러스 분리가 유용한 접근법입니다.

바이러스는 바이러스 스톡을 생성하기 위해 세포 배양에서 증식될 수 있습니다. 배양된 세포는 시드 바이러스, 상업적 공급원 또는 감염된 조직으로부터 얻은 바이러스 스톡으로 접종됩니다. 접종 후, 바이러스 입자를 수확하기 위해 감염된 세포를 용해시키거나, 방출된 바이러스를 세포 상청액에서 직접 수확합니다. 그런 뒤 바이러스 스톡의 역가를 산출하고, 분주하고, 차후 사용을 위해 -80°C에서 보관합니다.

임상 시료에서 획득한 바이러스의 분리 역시 세포 증식을 위해 세포 배양을 사용합니다. 임상 시료는 시료를 균질화하고 액체 배지로 추출하여 준비하게 되며, 원심분리를 한 뒤에 세포 배양을 접종하기 위해 사용됩니다.

높은 역가의 바이러스 스톡을 얻으려면 정제된 바이러스 입자의 농축이 필요합니다. 재생 셀룰로오스 멤브레인이 포함된 Amicon^® Ultra 및 Centricon^® Plus 원심분리 Ultrafiltration 장치는 비리온 및 바이러스 용액을 농축하는 데 사용될 수 있습니다(그림 1). 이 프로토콜에서는 세 가지 일반적인 바이러스 유형인 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV)의 농축을 위한 Amicon^® 및 Centricon^® 원심분리 Ultrafiltration 장치 사용에 대해 설명합니다.

바이러스 증식을 위한 일반적인 방법

1. 패키징 세포: 숙주 세포는 80~85% 밀집도를 달성하도록 플레이팅되었습니다.
2. 트랜스펙션: 세포는 생육 가능한 바이러스 입자로 감염되었습니다.
3. 바이러스 수확: 바이러스에 따라 각 세포 상청액이나 펠릿화된 세포 또는 둘 다 재조합형 비리온을 정제하는 데 사용되었습니다. 세포에서 바이러스를 방출하기 위해 동결/해동 주기가 4회 적용되었습니다. 그런 뒤 세포 잔해는 원심분리를 이용하여 세포 용해물로부터 분리되었습니다. 
   
4. 바이러스 정제: 바이러스는 밀도 구배 초원심분리 또는 컬럼/멤브레인 크로마토그래피를 이용하여 세포 용해물로부터 정제되었습니다.
5. 정제된 바이러스 용액은 Amicon^® Ultra 및 Centricon^® Plus 70 장치로 각각 수동적(passive) 투석, 투석 여과 또는 원심분리 Ultrafiltration를 이용하여 농축되고 적절한 보관 용액으로 버퍼 교환되었습니다.

고역가 바이러스 스톡을 위한 바이러스 농축

고역가 바이러스 스톡을 생산하기 위해, 정제된 바이러스를 원심분리 Ultrafiltration로 농축할 수 있습니다. 장치, 멤브레인 재질, 분자량 한계 또는 컷오프, 원심분리 속도, 원심분리 시간 및 버퍼 구성을 올바르게 선택하는 것은 감염성 바이러스 입자의 높은 회수율을 위해 매우 중요합니다. Amicon^® Ultra 원심분리 Ultrafiltration 기기는 필터 멤브레인에 의해 정의된 공칭 분자량 한계(NMWL)에 특화되어 있습니다. 50kDa NMWL Ultracel^®을 포함하는 Amicon^® Ultra 원심분리 Ultrafiltration 장치는 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 용액을 농축하기 위해 사용되었습니다. 렌티바이러스 농축을 위해서는 50kDa 및 100kDa NMWL 멤브레인을 둘 다 포함하는 장치가 사용되었습니다.

Ultrafiltration 방법 및 멤브레인 공칭 분자량 크기 선택 시 고려해야 할 요소:

1. 바이러스 입자 크기: 크기는 간행된 자료 출처 또는 현미경, 레이저 회절, 동적 광산란과 같은 측정 기술로 추정될 수 있습니다.
2. 용액 내 핵심 분리 대상의 크기: 분리해야 하는 단백질, 항체, 약물, 화학물질, 기타 입자의 크기는 멤브레인 크기 선택에 영향을 미칩니다.
3. 시료 부피: 0.5mL 이하에서 70mL까지 범위의 공정 부피는 원심분리 Ultrafiltration(cUF) 장치에 적합합니다.

바이러스 입자를 잔류시키려면 필터 멤브레인의 분자량 컷오프가 입자보다 작아야 하지만(바이러스 입자의 분자량보다 약 2배 더 작아야 함), 더 작은 구성 성분이 필터를 통과할 만큼 충분히 커야 합니다
(표 1).

표 1. 바이러스 입자 크기에 따른 Ultrafiltration 멤브레인 NMWL의 선택.

Ultrafiltration 멤브레인 NMWL(kDa)	공칭 공극 크기(nm)	권장하는 Ultrafiltration 공칭 잔류 크기의 범위
		직경(nm)		분자량(kDa)
		최소	최대	최소	최대
3	0.3	1	1.5	6	20
10	1	3	9	20	90
30	3	9	15	60	180
50	5	15	30	100	300
100	10	30	90	200	900

Amicon^® Ultra 원심분리 Ultrafiltration 장치를 이용하는 바이러스 농축

표 2에서는 미가공 세포 용해물 및 크로마토그래피로 정제된 바이러스로부터 얻은 아데노바이러스, 렌티바이러스, AAV의 농축 결과를 보여줍니다. 바이러스 입자는 Amicon^® Ultra 원심분리 Ultrafiltration 장치를 이용하여 높은 회수율과 함께 효과적으로 고역가로 농축되었습니다.

표 2. Ultrafiltration 장치를 이용한 바이러스 농축. 1013 입자/mL를 초과하여 바이러스를 농축하는 것은 잠재적인 바이러스 응집 때문에 권장하지 않습니다.

시작 시료	장치	시작 바이러스 역가	시작 부피(mL)	농축 인자	1500 x g (min)에서 회전 시간	회수율(%)
미가공 세포 용해물 내 아데노바이러스	Amicon® Ultra-4 50kDa	1 x 108	4	27X	20	>100
1M 소금 버퍼에서 정제된 아데노바이러스	Amicon® Ultra-4 50kDa	1 x 108	4	45X	10	85
미가공 세포 용해물 내 AAV	Amicon® Ultra-4 50kDa	2 x 107	4	20X	35	50
미가공 세포 용해물 내 AAV	Amicon® Ultra-15 50kDa	2 x 107	10	25X	45	76
100mM Tris, 250mM NaCl 버퍼 내 희석된 AAV	Amicon® Ultra-4 50kDa	5 x 106	4	20X	20	100
세포 배양 상청액 내 렌티바이러스	Amicon® Ultra-4 100kDa	9 x 104	4	100X	30	>100
세포 배양 상청액 내 렌티바이러스	Amicon® Ultra-4 50kDa	9 x 104	4	100X	30	93
세포 배양 상청액 내 렌티바이러스	Centricon Plus-70 100kDa	8 x 103	65	80X	30	81

대부분의 바이러스는 저염 버퍼에서 효율적으로 농축 및 보관될 수 없다는 것을 유념하는 것이 중요합니다. 250mM 미만의 소금 용액에서 바이러스를 원심분리 농축하는 것은 바이러스 응집 및 감염력 저하의 결과를 초래합니다.

농축된 바이러스 스톡은 0.22µm 필터를 통해 여과 멸균될 수 있습니다. Ultrafree^®-MC GV 필터 기기는 0.5mL 미만의 부피에 사용할 수 있습니다.

결론

머크는 Amicon^® Ultra 및 Centricon^® Plus 원심분리 장치를 고역가 바이러스를 얻기 위한 빠르고 비용 효과적인 방법으로서 사용하여 Ultrafiltration을 검증하는 방법을 개발하였습니다. 이 방법은 세포 배양 상청액, 세포 용해물, 기타 공급원으로부터 얻은 바이러스를 농축하는 데 사용될 수 있습니다. 농축 후, 바이러스 스톡은 Ultrafree^® 필터 기기를 사용하여 여과 멸균될 수 있습니다. 감염성 바이러스 입자의 회수율을 가장 높이기 위해 적절한 Ultrafiltration 장치, 멤브레인 필터, 분자량 컷오프(MWCO), 원심분리 속도, 원심분리 시간을 선택하는 것이 매우 중요합니다.

원심분리 Ultrafiltration 장치

장치 공칭 분자량 한계, NMWL(kDa)	Amicon® Ultra 원심분리 Ultrafiltration 장치				Centricon® Plus 70 원심분리 장치
	0.5mL	2mL	4mL	15mL	15~70mL
3	UFC5003		UFC8003	UFC9003	UFC7003
10	UFC5010	UFC2010	UFC8010	UFC9010	UFC7010
10 (IVD*)			UFC4010D*	UFC9010D*
30	UFC5030	UFC2030	UFC8030	UFC9030	UFC7030
50	UFC5050	UFC2050	UFC8050	UFC9050
100	UFC5100	UFC2100	UFC8100	UFC9100	UFC7100

* IVD 사용을 위해 등록됨