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抗HA抗体のトラブルシューティング

抗HA（12CA5）抗体は、ヒトインフルエンザ血球凝集素（HA）タンパク質由来の9アミノ酸配列（YPYDVPDYA）を認識します。このエピトープは、その位置（N-末、C-末、内部）にかかわらず、融合タンパク質内においても認識されます。以下のトラブルシューティング情報は、ドットブロット法、免疫化学、免疫沈降、ウエスタンブロット法などの免疫検出用途に関連しています。

抗HA（12CA5）抗体（製品番号ROAHA）

化学発光シグナルまたは発色シグナルが弱いか、見えない

タグ付けされたタンパク質の分離が不十分
— 別の細胞溶解手順を用いてください

抗体濃度が薄すぎる
— 抗HAまたは二次抗体、あるいはその両方の濃度を2倍にしてください

ゲル上のタンパク質が不十分
— ゲルにより多くのタンパク質をアプライします。

ゲルからメンブレンへのタンパク質の転写が不十分
— ブロットの電流または転写時間、あるいはその両方を増やします。転写中、メンブレンとゲルの間に気泡がないことを確認してください。

メンブレンのタイプが間違っている
— シグナルを最大にするには、PVDFメンブレンを使用して転写します。

抗体のインキュベーション時間が短すぎる
— 抗HA抗体または二次抗体、あるいはその両方をメンブレンブロットで長時間インキュベートします。

シグナルの発生時間が短すぎる
— 発生時間を2倍にします。

洗浄時間が長すぎるか、洗浄条件が厳しすぎる
— 洗浄時間を短くします。洗浄バッファーからTween 20を除きます。

抗体に標識されたの酵素が防腐剤によって不活化されている
— ペルオキシダーゼ標識抗体を使用する場合は、ウエスタンブロット試薬にアジ化ナトリウムを使用しないでください。

基質が不活性
— 基質を新たに希釈するか、別の基質ストック溶液から始めます。

タンパク質分解による切断が原因で、エピトープタグ配列を検出できない
— 細胞溶解バッファーにプロテアーゼ阻害剤を加えます。

発現レベルが低いため、エピトープタグ配列を検出できない
— 代替の発現システムを使用するか、発現システムを最適化します。複数のタグ配列を標的タンパク質に挿入して、抗体反応の結合力を高めます。

翻訳が本来よりも早く終了した結果、C末端タグが喪失し、エピトープタグ配列を検出できない
— 標的遺伝子内の別の挿入部位をエピトープタグ配列に使用します。

ブロットにおけるバックグラウンドの上昇とエキストラバンドの出現

抗体濃度が濃すぎる
— 抗HA抗体または二次抗体、あるいはその両方の濃度を半分に減らします。

洗浄時間が短すぎる
— 洗浄時間を長くします。メンブレンと基質のインキュベーションが長すぎる — ブロットメンブレンを基質溶液に浸す時間を短くします。

メンブレンのタイプが間違っている
— バックグラウンドを最小限に抑えるには、PVDFメンブレンを使用して転写します。

ブロッキング試薬が薄すぎる
— 試薬希釈液に溶解した脱脂粉乳（5% w/v）をブロッキング試薬として使用します。注記：高濃度の脱脂粉乳は、バックグラウンドだけでなく特定のシグナルも減少させる可能性があります。

試薬または機器が汚染されている
— 清潔な機器、新しく調製したバッファー、新しいメンブレンを使用します。手袋とピンセットを常に使用し、メンブレンに素手で触れないでください。

二次抗体がタグなしタンパク質に結合する
— 完全なIgGではなく、二次抗体のF（ab′）₂断片を使用します。

一次抗体の重鎖と軽鎖がブロットメンブレン上に現れる
— タグ付けされたタンパク質を視覚化するには、ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体による直接検出を行います。

シグナルの発生時間が長すぎる
— 発生時間を半分に減らします。