qPCRの仕組み

リアルタイム PCR は、定量的 またはqPCR とも呼ばれ、特定のサイクルで存在する実際の PCR 産物の量を決定します。PCR反応でレポーター蛍光色素を使用することにより、qPCRアッセイでのDNAの生成量を測定できます。qPCRには、SYBR®グリーンベースと プローブベースの2通りの方法があります。

SYBR®グリーンベースのqPCR

SYBR®グリーンqPCRでは、二本鎖DNA配列の増幅をモニタリングできます。プローブを必要としないため、アッセイのセットアップと実行にかかるコストが削減されます。また、増幅された単一の分子に複数の色素を結合できるため、増幅産物の検出感度が向上します。

SYBR®グリーンqPCRの動画のトランスクリプト

リアルタイム PCR は、定量的 またはqPCR とも呼ばれ、特定のサイクルで存在する実際の PCR 産物の量を決定します。PCR反応でレポーター蛍光色素を使用することにより、qPCRアッセイでのDNAの生成量を測定できます。 

SYBR®グリーンqPCR反応系には、分析対象の標的配列を含んだテンプレートがあります。また、選択したプライマー、dNTP、DNAポリメラーゼも必要です。SYBR®グリーンI色素は通常、DNAポリメラーゼを有する反応ミックスに含まれています。

変性は、PCR反応の最初のステップです。サーマルサイクラーは約95 ℃まで加熱されます。これにより、二本鎖DNAの二重らせん構造が融解して2つの一本鎖DNAテンプレートになります。

アニーリングステップでは、温度が45〜65 ℃に冷却され、一本鎖プライマーが標的配列の適切な末端に付着します。このサイクルの間、DNAポリメラーゼはプライミングされたテンプレートに付着し、相補的なヌクレオチドの取り込みを開始します。

最後の伸長では、温度は65〜75 ℃までわずかに上昇します。DNAポリメラーゼは、相補的なヌクレオチドをDNAテンプレートに取り込むことで、配列特異的なプライマーを伸長します。

SYBR®グリーンIは、新しく合成された二本鎖DNAの複合体をすべて結合して蛍光を発します。蛍光はPCRのサイクルが続くに伴って蓄積し、各PCRサイクルの最後に測定されます。バックグラウンドレベル（Cq値）を超えるSYBRグリーンIによって生成された蛍光の強度が測定され、新しく生成された二本鎖DNAの量を定量化するために使用されます。

変性、アニーリング、伸長のサイクルを約35〜40回繰り返した後、分析を開始する準備が整います。Cq値を使用して、DNAの開始量を定量化し、遺伝子発現の研究やその他の分析で使う標準曲線を確立できます。

SYBR®グリーンqPCRは、二本鎖DNA配列の増幅をモニタリングする優れた手段となります。プローブを必要としないため、アッセイのセットアップと実行にかかるコストが削減されます。また、増幅された単一の分子に複数の色素を結合できるため、増幅産物の検出感度が向上します。

機器の互換性はqPCRにとって重要です。機器に適した製品を選択するようにしてください。また、qPCRの方法は、忠実度、速度、利便性のレベルによって異なります。SigmaAldrich.com/PCRで最適な製品を選択できるよう、PCR選択ガイドとメルクのテクニカルサポートチームを活用することをお勧めします。

プローブベースのqPCR

プローブベースのqPCRにより、特異的なハイブリダイゼーションが可能になります。プローブベースのqPCRの標的を絞った性質により、バックグラウンドが低くなり、偽陽性の結果を避けることができます。また、複数の異なる識別可能なレポーター色素でプローブを標識し、1本の反応チューブ内で2つの異なる配列を増幅することも可能です。

プローブベースのqPCRの動画のトランスクリプト

リアルタイムPCR（定量PCRまたはqPCRとも呼ばれる）は、特定のサイクルに存在するPCR産物の実際の量を測定する手法です。PCR反応でレポーター蛍光色素を使用することにより、qPCRアッセイでのDNAの生成量を測定できます。 

プローブベースqPCR反応系には、分析対象の標的配列を含んだテンプレートがあります。また、選択したプライマー、dNTP、DNAポリメラーゼも必要です。さらに、レポーター分子とクエンチャー分子の両方で標識されたプローブも必要になります。通常、プローブは標的配列に特異的であるため、個別のカスタム製品として販売されます。

変性は、PCR反応の最初のステップです。サーマルサイクラーは約95 ℃まで加熱されます。これにより、二本鎖DNAの二重らせん構造が融解して2つの一本鎖DNAテンプレートになります。

アニーリングステップでは、温度が45〜65 ℃に冷却され、一本鎖プライマーが標的配列の適切な末端に付着します。このサイクルの間、DNAポリメラーゼはプライミングされたテンプレートに付着し、相補的なヌクレオチドの取り込みを開始します。

最後の伸長では、温度は65〜75 ℃までわずかに上昇します。このフェーズの間、DNAポリメラーゼは、相補的なヌクレオチドをDNAテンプレートに取り込むことで、配列特異的なプライマーを伸長します。次に、DNAポリメラーゼがレポーター分子をプローブから移動させ、蛍光を発します。

蛍光はPCRのサイクルが続くに伴って蓄積し、各PCRサイクルの最後に測定されます。バックグラウンドレベル（Cq値）を超えるレポーター分子によって生成された蛍光の強度が測定され、新しく生成された二本鎖DNAの量を定量化するために使用されます。

変性、アニーリング、伸長のサイクルを約35〜40回繰り返した後、分析を開始する準備が整います。Cq値を使用して、DNAの開始量を定量化し、遺伝子発現の研究やその他の分析で使う標準曲線を確立できます。

プローブベースのqPCRは、特異的ハイブリダイゼーション、偽陽性の排除、1本の反応チューブ内での2つの異なる配列の増幅が必要な場合の最適なオプションです。

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