Duolink® PLA Probemakerガイド

このガイドでは、Duolink^® PLA実験で使用する抗体にPLAオリゴヌクレオチド（PLUSまたはMINUS）を結合させるためのDuolink^® In Situ Probemakerの使用について説明します。Probemakerが生成したPLA抗体は、PLUS PLAプローブとMINUS PLAプローブが使用されている限り、標準のDuolink^® PLAプローブと併用することも、単独で使用することもできます。Probemakerの用途の詳細については、「独自のPLA^®プローブの作製」、および『Duolink^® PLAトラブルシューティングガイド』の「Duolink^® Probemaker」セクションをご覧ください。

Duolink^® PLAテクノロジーについて詳しくは、カタログをダウンロードして、「Duolink^®近接ライゲーションアッセイを最適化する方法」で詳細を確認してください。Duolink^® PLAプロトコルに加え、Probemakerで生成されたPLA抗体の使用に必要なその他のDuolink^® PLA試薬に関する情報は、Duolink^®リソースセンターに掲載されています。

アプリケーション
製品と機器
Duolink^® PLA Probemaker結合プロトコル
Duolink^® PLA検出プロトコル
トラブルシューティング

アプリケーション

Duolink^® Probemakerは、現行のDuolink^® PLAプローブを単独で使用することが不可能または理想的でない状況で役立ちます。このセクションでは、Duolink^® Probemakerの一般的なアプリケーションについて説明します。

1.同種の一次抗体の使用

同種に由来する2つの一次抗体を使用する場合は、Duolink^® Probemakerを使用して、一方の抗体をPLA PLUSオリゴヌクレオチドと結合させ、もう一方をPLA MINUSオリゴヌクレオチドと結合させることができます。直接結合した一次抗体のみを使用する場合、二次抗体やDuolink^® PLAプローブは不要であり、PLAプロトコルのこのステップを排除する必要があります。

2.任意の一次抗体の使用

Duolink^® PLAプローブの現行の製品は、マウス、ウサギ、またはヤギ由来のIgGを認識するPLA結合二次抗体です。マウス、ウサギ、またはヤギ以外の種に由来する2つの一次抗体を使用する場合は、Duolink^® Probemakerを使用して、一次抗体または適切な二次抗体のいずれかをPLAオリゴヌクレオチドで標識することが可能です。一方の抗体をPLA PLUSオリゴヌクレオチドと結合させ、もう一方の抗体をPLA MINUSオリゴヌクレオチドと結合させてください。

一方の一次抗体だけがマウス、ウサギ、またはヤギ以外の種に由来する場合は、PLUS PLAプローブとMINUS PLAプローブが使用されている限り、Duolink^® Probemakerで生成されたPLA抗体と標準のDuolink^® PLAプローブを併用できます。

3.組織サンプルと同種に由来する一次抗体の使用（例：「マウスオンマウス」）

マウス由来の一次抗体を使用してマウス組織を染色すると、染色対象組織の内因性マウスIgGへの二次抗体の結合、およびB細胞、形質細胞、マクロファージのFc受容体への二次抗体の結合に起因する高バックグラウンドが出現することがよくあります。抗マウス二次抗体の使用を回避して、バックグラウンドを低減できるよう、Duolink^® Probemakerを使用して、マウス由来の一次抗体をPLAオリゴヌクレオチドと直接結合させてください。

製品と機器

Duolink^® Probemaker試薬

特定の製品の推奨事項については、『Duolink^® PLA製品選択ガイド』を参照してください。Duolink^® Probemakerを使用すると、PLUS PLAプローブとMINUS PLAプローブが使用されている限り、標準のDuolink^® PLAプローブと併用することも、単独で使用することもできる、カスタムのPLAオリゴヌクレオチド結合抗体を作製できます。各Duolink^® PLA Probemakerキットには、20 µgの抗体を1 mg/mLの濃度で結合する試薬が含まれています。試薬には以下が含まれます。

1. Duolink^® PLAオリゴヌクレオチド – 凍結乾燥され、活性化されたオリゴヌクレオチド（PLUSまたはMINUS）が入ったバイアル1つ
2. 結合バッファー – 結合反応の緩衝
3. 停止試薬 – 結合反応の停止
4. 保存溶液 – 結合抗体（PLAプローブ）の保存
5. 20xアッセイ試薬 – 実験者用に最適化された抗体希釈液に必要に応じて付加
6. ブロッキング溶液 – 一次抗体のインキュベーション前にサンプルをブロック
7. PLAプローブ希釈剤 – 結合抗体（PLAプローブ）を最終アッセイ濃度に希釈

注記：すべての試薬は-20℃で保存してください。抗体の結合後は、4℃で保存します。

その他の関連製品

1. 一次抗体または二次抗体 – PLAオリゴヌクレオチド（PLUS／MINUS）との結合。抗体が結合するには、次の基準を満たしている必要があります。

   1. 結合する抗体の濃度は1 mg/mLであることが必要です。結合ごとに20 µg（= 20 µL）の抗体が必要です。

      注記：モノクローナル抗体を用いる場合は、タンパク質Aまたはタンパク質Gでアフィニティ精製を行う必要があります。

   2. 抗体はアミンフリーの緩衝液、望ましくはPBS中になければなりません。バッファーは担体および防腐剤を含有しないものであることが必要ですが、最大0.1%のBSA、5%のトレハロース、および0.02%のアジ化ナトリウムを含んでいても構いません。

      注記：抗体の保存に使用しているバッファーの組成が不明な場合は、結合の前に透析またはバッファーの交換を行うことをお勧めします。

      注記：希釈された抗体をDuolink^® In Situ Probemakerによる結合の前に濃縮することは、フィルタータイプの濃縮器では損失が非常に大きくなるため、抗体が大量にある場合を除き推奨されません。

2. 1x PBS – 抗体のバッファーを必要に応じて交換する場合。バッファー交換の推奨手順は次のとおりです。

   注記：この手順の目的は、高濃度のBSA等の高分子を減らすことではありません。

   1. スピンカラムを1x PBSで使用前に平衡化するために、まず、3,000 rpmで1分間カラムを遠心し、次に400 µLの1x PBSを加えて再度1分間遠心するという手順を、4回繰り返します。カラムを新しいマイクロチューブにセットします。

   2. 抗体（12〜50 µL）をカラムに加え、3,000 rpmで2分間再度遠心します。収集した抗体の濃度をOD値で確認してください。1 mg/mLの濃度が、OD 280 nmのときに1.4であることが必要です。

   注記：Microcon-10遠心フィルターユニット（製品番号MRCPRT010）が適しています。

Duolink^® PLA Probemaker結合プロトコル

この結合プロトコルでは、PLAオリゴヌクレオチド（PLUSまたはMINUS）を任意の抗体に結合する方法について説明します。開始する前に、結合対象の抗体が1 mg/mLの濃度でアミン非含有バッファーに含まれていることを確認してください。抗体バッファーは担体および防腐剤を含有しないものであることが必要ですが、最大0.1%のBSA、5%のトレハロース、および0.02%のアジ化ナトリウムを含んでいても構いません。使用前にすべての液体試薬をボルテックスします。

1. 結合対象の抗体20 µLに結合バッファー2 µLを付加します。抗体濃度は1 mg/mLであることが必要です。
2. 軽くピペッティングして混合します。
3. 抗体溶液を凍結乾燥オリゴヌクレオチド（PLUSまたはMINUS）の1つのバイアルに移します。
   注記：凍結乾燥オリゴヌクレオチドのバイアルを開けた直後に抗体溶液を付加してください。
4. 軽くピペッティングして混合します。
5. 室温で一晩インキュベートします。
6. 2 µLの停止試薬を反応液に付加します。
7. 室温で30分間インキュベートします。
8. 24 µLの保存液と、必要に応じて他の試薬を加えて、特異的な抗体を安定させます。
   
9. 安定化が完了したら、PLAプローブを4℃の保存溶液に保存できます。

Duolink^® PLA検出プロトコル

Duolink^® PLA蛍光検出プロトコルまたはDuolink^® PLA明視野検出プロトコルは、PLUS PLA結合抗体とMINUS PLA結合抗体が使用されている限り、Probemakerで生成された抗体で標準のDuolink^® PLAプローブと併用することも、単独で使用することもできます。次の変更は、PLAプローブに基づく実験に影響を与える可能性があることに注意してください。

1. Probemakerキットに含まれるPLAプローブ希釈液は、蛍光検出プロトコルと明視野検出プロトコルの両方でDuolink^®抗体希釈液の代わりに使用する必要があります。

2. オプション：付属のPLAプローブ希釈液の代わりにカスタム抗体希釈液を使用する場合は、PLA結合抗体で使用する前に、20xアッセイ試薬をカスタム抗体希釈液で1:20に希釈しておくことをお勧めします。

3. 蛍光検出および明視野検出プロトコルの適切なステップでPLA結合抗体をインキュベートします。一次抗体を結合に使用した場合は、一次抗体のインキュベーションステップ（ステップ2の蛍光検出、ステップ3の明視野検出）で使用します。二次抗体を結合に使用した場合は、PLAプローブのインキュベーションステップ（ステップ3の蛍光検出、ステップ4の明視野検出）で使用します。

4. 直接結合した一次抗体のみを使用する場合、二次抗体やDuolink^® PLAプローブは不要です。そのため、蛍光検出（ステップ3）および明視野検出（ステップ4）プロトコルのPLAプローブインキュベーションステップはスキップします。これ以外のPLAプローブの組み合わせについては、プロトコルの記載内容に従ってください。

トラブルシューティング

『Duolink^® PLAトラブルシューティングガイドのヒント』、一般的なトラブルシューティングガイドライン、一連のよくある質問（FAQ）を参照してください。

最寄りの営業担当者（または実験のサポートが必要な場合はテクニカルサポートチーム）にいつでもお気軽にお問い合わせください。

カスタムサービス

実験に追加のカスタマイゼーションが必要な場合は、お問合せください。Duolink^® PLAプロジェクトを加速するカスタムサービスプログラムの詳細をご確認ください。

参考文献

1. Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius K, Andersson A, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, et al. 2007. In SituDetection of Phosphorylated Platelet-derived Growth Factor Receptor ? Using a Generalized Proximity Ligation Method. Mol Cell Proteomics. 6(9):1500-1509. https://doi.org/10.1074/mcp.m700166-mcp200

2. Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947

3. Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegard M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. 2004. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(22):8420-8424. https://doi.org/10.1073/pnas.0400552101

4. Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Östman A, Landegren U. 2002. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20(5):473-477. https://doi.org/10.1038/nbt0502-473