チオール修飾オリゴ（SH修飾オリゴ）ヌクレオチドのDDT還元プロトコル

ジスルフィド結合の還元

このプロトコルは、チオール修飾オリゴヌクレオチドのジスルフィド結合を還元し、 sulfhydryl基にするためのものです（図1）。sulfhydryl基は、オリゴヌクレオチドを金ナノ粒子などの固体表面に付着させるのに使用できます。Cleland試薬とも呼ばれるジチオスレイトール（DTT）を用いたジスルフィド結合の還元によって、使用が可能になります。

図1 5'-Thiol-Modifier C6 S-Sオリゴヌクレオチドのジスルフィド結合還元の例。輸送中や保存中の酸化反応を防ぐため、チオール修飾オリゴヌクレオチドはジスルフィド型で出荷されます。

消耗品

• ・2mL遠心チューブ
• ・ピペットチップ
• ・Milli-Q^®H₂O
• ・DTT （D9779）
• ・NAP™-10カラム（GE17-0854-01）
• ・リン酸ナトリウム緩衝液
• ・チオール修飾オリゴヌクレオチド

方法

還元方法は、以下の2つの主要ステップに分かれています。1）sulfhydryl基形成、2）副生成物の除去

Sulfhydryl Formation

1. Prepare a 100 mM solution of DTT in 100 mM sodium phosphate buffer, pH 8.3 - 8.5. For 5 mL, dissolve 77.13 mg of DTT in buffer.
2. For up to 12.5 OD (optical density units; for >12.5 OD, maintain a 10:1 ratio of DTT solution to OD of oligonucleotide), dissolve the thiol-modified oligonucleotide in 125 µL of the DTT solution.
3. Incubate at room temperature for 1 hr.

Byproduct Removal

1. Equilibrate a NAP-10 column with approximately 15 mL of 100 mM sodium phosphate buffer, pH 6.0. Allow the equilibration buffer to enter the gel bed completely.
2. Add 1.0 mL of the reaction mixture to the NAP-10 column (bring the reaction mixture volume to 1.0 mL with sodium phosphate buffer, pH 6.0 as needed). Allow the reaction mixture to enter the gel bed completely.
3. Elute the thiol-modified oligonucleotide into a centrifuge tube with 1.0 mL of sodium phosphate buffer, pH 6.0.

補足

リン酸ナトリウム緩衝液は（pH8.3～8.5とpH6.0のいずれも）、実験室の標準的手法に従って調製してください。バッファーはすべてMilli-Q^®水で調製してください。