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ブロッキング試薬のプロトコル＆トラブルシューティング

プロトコル

10xストック溶液の調製

ブロッキング試薬は、マレイン酸バッファーに溶解し[100 mMマレイン酸、250 mM NaCl、pH 7.5（20℃） conc. NaOHまたは固体のNaOHを用いて調整]、振とうおよび加熱（ heating block上で+60℃で約1時間、もしくは試薬が完全に溶解するまで、または電子レンジで計3～4分）により最終濃度を10%（w/v）に調整します。ブロッキング試薬は、溶解しながら加熱する必要がありますが、沸騰させてはいけません。沸騰により試薬が凝固します。ブロッキング試薬がこの溶液に溶解しない場合、溶液のpHを確認し、必要に応じて調整し、加熱を継続します。

注記：10xブロッキング溶液をマレイン酸バッファーで1xブロッキング溶液に希釈します。常に用時調製します！

ブロッキング試薬および全組織標本

in situハイブリダイゼーションの手順の間、非特異的バックグラウンドは、RocheのtRNAまたはRocheの魚精子DNAをハイブリダイゼーション溶液に添加することにより効率的に改善します。

ブロッキング試薬は、非放射活性のハイブリダイゼーションおよび核酸ハイブリッドの検出において、バックグラウンドを低減させるために使用されます。1）検出前のブロッキングは任意です。ブロッキング試薬または抗体の宿主と同じ動物由来の血清（例えばヒツジ）のいずれかを使用します。抗体は、バックグラウンド低減のため、全組織標本で1時間の事前吸着処理を行うことができます。

「ISHの免疫学的検出における使用」のためのプロトコル

詳細については、Rocheの非放射性In situハイブリダイゼーションマニュアル中のDIG-RNAプローブ＆組織切片をご参照ください。

最終洗浄後、免疫学的検出を継続します。

8枚のスライドに適したトレイに30 mLのバッファーとともにスライドを静置します。以下のとおりインキュベートします（そして、バックグラウンドを避けるため、溶液だけではなくトレイも交換し、インキュベーションの間に追加のトレイのセットを洗浄します）。

バッファー1［100mM Tris-HCl pH7.5、20℃；150 mM NaCl］5分
バッファー2［0.5%（w/v）ブロッキング試薬を含有するバッファー1］1時間
バッファー3［1%（w/v)）BSA、0.3%（v/v）Triton X-100を含有するバッファー1］1時間
余分なバッファー3を流し（組織を乾燥させないこと）、バッファー4（抗DIG-APを含有するバッファー3、標的に応じ1：1,000～1：3,000）100 μLを組織上に添加します。

使用直前に調製します

室温で1時間、湿室内でインキュベートします
バッファー3で4回洗浄します（20分）
バッファー1で5分、平衡化します
バッファー5［100 mM Tris-HCl（pH 9.5、20℃；100 mM NaCl；50 mM MgCl₂）］で5分、インキュベートします。
暗所で呈色反応（例えばNBT/BCIP）を行います。蒸発を避けるためトレイを覆います。適切な時間間隔で確認します。酵素反応を終了し、バックグラウンドを洗い流します。

マイクロアレイ

一般的に、Rocheはバックグラウンドシグナルをできる限り低くするため、エポキシまたはその他の非電荷表面を有するアレイの使用を推奨します。

最も重要なことは、蛍光色素結合抗DIG添加前の適切なブロッキングです。Rocheは、DIG洗浄バッファーおよびブロックバッファーセットに含まれるブロッキングバッファーの使用を推奨します。

最初に、ハイブリダイゼーション後のアレイを洗浄します。その後、0.1%Tween 20を含有する2x PBSに溶解した1%ブロッキング試薬溶液を用いて、プレブロックします。色素標識抗DIGを0.1%Tween 20を含有する2x PBSに溶解した1%ブロッキング試薬で希釈し、アレイにアプライします。洗浄には、2x PBS、0.1%Tween 20を使用します。または、DIGブロッキング試薬または5%デンハルト試薬の代わりに1%BSA含有バッファーを使用することができます。

トラブルシューティング

濃度上限5%

ブロッキング試薬の濃度は5%まで可能です。これは、バックグラウンドの改善に有効です。大半の標準的なDIGアプリケーションには、この推奨濃度で十分です。ビオチン検出には、5%の濃度を使用します。

ブロッキング試薬の最も簡単な方法は、RocheのDIG洗浄バッファーおよびブロックバッファーセット（製品番号01585762001）はすぐに使用できるストック溶液のセットですのでブロッキング試薬が最も簡単に使用できます。

バックグラウンド染色が高い

その理由は、標識DNAによる組織中のタンパク質または他のDNA結合分子に対するおそらく非特異的な接着です。高いバックグラウンド染色を減らすには、プロトコルヘルプコーナーに記載されているアドバイスに従います。特に、抗体ミックスを事前に吸着させることを検討してください。