Purificación de péptidos séricos para espectrometría de masas MALDI con filtros para ultracentrífuga Amicon^®

Los biomarcadores desempeñan un papel esencial en el proceso de descubrimiento y desarrollo de fármacos. Proporcionan potentes pistas sobre la vulnerabilidad genética, la progresión de la enfermedad y la respuesta a los medicamentos. El suero es una fuente clave de posibles biomarcadores proteicos. Un impedimento importante para descubrir nuevos biomarcadores es la presencia de sales, proteínas y lípidos en plasma o suero, lo que interfiere en el análisis peptídico mediante espectrometría de masas. Pueden utilizarse varios protocolos para extraer y enriquecer péptidos de los tejidos y los líquidos corporales:

• Después de la precipitación proteica, fraccionar mediante cromatografía de fase inversa sobre resina C18
• Precipitación de proteínas grandes con acetonitrilo, al tiempo que mejora la solubilidad de las proteínas más pequeñas y los péptidos
• Ultrafiltración para la preparación de fracciones de bajo peso molecular destinadas al análisis de biomarcadores^1–4

La ultrafiltración en combinación con la extracción en fase sólida (SPE) en resina C18 es un método cómodo y eficaz para la purificación de péptidos séricos. Este enfoque proporciona más péptidos para el análisis mediante espectrometría de masas que el método de precipitación con acetonitrilo. Además, recientemente se ha optimizado la preparación de muestras con ayuda de un filtro (FASP), que se desarrolló en un principio utilizando nuestros filtros para centrífuga Microcon^®5, para su uso en los filtros para ultracentrífuga Amicon^®6.

Una ventaja de FASP es que se puede cambiar la disolución tampón y concentrar las muestras mediante varias centrifugaciones sin preocupaciones de secado o precipitación. Además, FASP se adaptó al formato de placa de 96 pocillos utilizando nuestras placas de filtración MultiScreen^®7. La adaptación al formato de 96 pocillos permitió un procesamiento rápido del material biológico y abrió posibilidades a la automatización del FASP en el futuro.

Métodos

I. Preparación de péptidos séricos

1. Diluir de 1 a 4 ml de suero, plasma o lisado celular con acetonitrilo al 10 % o con tampón tris HCL 10-20 mM pH 7,5 en una proporción 1:1.
2. Cargar la muestra en los filtros para centrífuga Amicon^® Ultra-4 10K NMWL y centrifugar en un rotor oscilante durante 15-30 minutos a 3 000 x g.
3. Recoger el filtrado.
4. Si la muestra contiene acetonitrilo, colocarla en una centrífuga Speed Vac para evaporar el reactivo; si no, continuar directamente con el paso 5.
5. Acidificar 10 μl de la muestra de filtrado utilizando 5 μl de TFA al 1 %.
6. Siguiendo el protocolo de las puntas de pipeta ZipTip^® μC18, desalar el concentrado y limpiar la muestra.
7. Eluir la muestra directamente en una placa MALDI con 2 μl de matriz de ácido ∂-ciano-4-hidroxicinámico (5 mg/ml en acetonitrilo al 50 %, TFA 0,1 %). Nota: si se añadió acetonitrilo al suero antes de la filtración, centrifugar brevemente las muestras en una centrífuga Speed Vac^® para eliminar el disolvente antes de la purificación ZipTip^®.

II. Análisis peptídico mediante espectrometría de masas utilizando el filtrado de los ultrafiltros para centrífuga Amicon^® Ultra 4 ml 10kDa

1. Acidificar los ultrafiltrados que contengan los péptidos procedentes de los lisados celulares o el suero humano con TFA al 1 % y concentrar en puntas de pipeta ZipTip^® μC18 o puntas de pipeta ZipTip^® con resina de intercambio catiónico fuerte siguiendo el procedimiento descrito en la guía del usuario.
2. Cubrir la muestra con 1 μl de matriz de ácido ∂-ciano-4-hidroxicinámico (5 mg/ml en acetonitrilo al 50 %, TFA al 0,1 %) y analizar en espectrómetro de masas MALDI.

III. Preparación de péptidos séricos mediante precipitación con acetonitrilo (muestras de control)

1. Diluir la muestra de suero como se indica en el apartado I.1) del protocolo anterior añadiendo acetonitrilo al 10 % en una proporción 1:1 (v:v).
2. Cargar la muestra en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar las muestras para precipitar las proteínas.
3. Recoger el sobrenadante y colocarlo en una centrífuga Speed Vac para evaporar el acetonitrilo.
4. Resuspender la muestra en TFA al 0,1 %, desalar y concentrar con las puntas de pipeta ZipTip^® μC18.
5. Realizar la co-elución directamente en una placa MALDI con 2 μl de matriz de ácido ∂-ciano-4-hidroxicinámico (5 mg/ml en acetonitrilo al 50 %, TFA 0,1 %).

Resultados

Los filtros para centrífuga Amicon^® Ultra-4 30K NMWL pueden utilizarse para preparar los péptidos séricos destinados a análisis mediante espectrometría de masas de alta resolución. Cuando se compara con el suero de rata sin procesar, la calidad de los datos mejora después de eliminar las proteínas grandes por precipitación con acetonitrilo (Figura 1A, B, a continuación). El número y la calidad de los picos de péptido detectados en MALDI-TOF mejoraron significativamente cuando se utilizó el suero ultrafiltrado (Figura 1B, a continuación).

La calidad de los datos mejoró aún más al incorporar la cromatografía de fase inversa en el protocolo de preparación de la muestra, ya fuera sola o en combinación con precipitación con acetonitrilo y ultracentrifugación (Figura 2, a continuación). Aquí, la punta de pipeta ZipTip^® μC18 sirvió como una herramienta cómoda y eficiente para la preparación de muestras a microescala antes de la espectrometría de masas. Se consiguieron la señal, la relación señal-ruido y el número de péptidos detectados más elevados con muestras preparadas utilizando los tres métodos (Figura 2D, a continuación).

Este enfoque puede utilizarse directamente en combinación con las puntas de pipeta ZipTip^® μC18 para la identificación peptídica mediante MS/MS o como un primer paso anterior al enriquecimiento de superficie ulterior utilizando los métodos SELDI-TOF. Estos protocolos pueden ser aplicables a otros marcadores de bajo peso molecular, como fármacos y metabolitos.