使用Superdex进行分离

缓冲液：10至50 mM磷酸钠，150 mM氯化钠，pH 7.0至7.4；或选择用来在下一步骤前存储或溶解样品的缓冲液。

使用150 mM氯化钠或具有相同离子强度的缓冲液，以避免pH依赖性离子与基质的相互作用。在非常低的离子强度下，基质上存在少量带负电荷的基团可导致碱性蛋白质的阻滞。

该过程需确保样品应完全溶解。离心或过滤以去除颗粒物（附录3）。始终使用脱气缓冲液并在运行期间保持恒定温度，以避免将空气引入层析柱。

在层析系统上设置适当的压力限制，以避免损坏层析柱填料。

首次使用或长期储存后

1. 用2倍柱体积的水平衡层析柱以去除储存溶液。使用低流速（表2.3）避免形成任何间隙。
2. 首次使用：根据层析柱压力限值设置（第1章）一节确定层析柱的特定压力限值。
3. 执行柱效测试（附录1）。
4. 在运行期间，用2倍柱体积含150 mM氯化钠的缓冲液平衡柱（表2.2）。
5. 使用相当于柱体积的0.5％至4％的样品体积。对于大多数应用，样品体积不应超过2％以达到最大的分辨率（3.2/300 GL和5/150 GL最多50μL，10/300 GL最多500μL，HiLoad 16/600最多2.4 mL，HiLoad 26/600最多6.4 mL）。请注意，小样品上样量可提高分辨率。
6. 用1倍柱体积的缓冲液洗脱。
7. 在进样新样品前，用缓冲液重新平衡层析柱，直到A₂₈₀监测的基线平稳。

应通过确定每米理论塔板数和峰对称性，定期检查层析柱性能。

请确保不超过层析柱的压力限制并考虑限制流速（表1.3）。当在低温下工作时（如在冷室中），或当柱子与20％乙醇或其他粘稠溶液一起使用时，这点尤其重要。暴露在4 °C至40 °C范围之外的温度会对填充床的效率产生负面影响，并且层析柱可能需要重新灌柱。

表2.3.在使用预装Superdex Increase、Superdex的层析柱，或装有制备级Superdex 填料的HiLoad层析柱时，不同阶段推荐的流速室温下的流速

 

 

室温下的流速 *HiLoad为了节省时间，可以使用更高的流速进行缓冲液平衡：HiLoad 16/600和HiLoad 26/600分别可设置为1.6 mL/min和4.3 mL/min。在进样之前，将流速降低到建议的流速。

	3.2/300 GL	5/150 GL	10/300 GL	HiLoad 16/600	HiLoad 26/600
首次使用或长期储存后	0.05 mL/min	0.3 mL/min	0.5 mL/min	1 mL/min* (30 cm/h)	2.6 mL/min* (30 cm/h)
首次使用或长期储存后（Superdex 200 Increase）	0.075 mL/min	0.3 mL/min	0.75 mL/min	N/A	N/A
原位清洗，CIP	0.02 mL/min	0.3 mL/min†	0.5 mL/min	0.8 mL/min (25 cm/h)	2.2 mL/min (25 cm/h)

†Superdex 200 Increase 5/150 GL的流速为0.13 mL/min。

清洁

1. 用1倍柱体积的0.5 M氢氧化钠或0.5 M乙酸进行清洗。在整个CIP程序中应使用低流速（表2.3）。
2. 立即用1倍柱体积的蒸馏水清洗，然后用至少2倍柱体积的缓冲液清洗，直至A₂₈₀监测基线和洗脱液的pH值保持稳定。

如果缓冲液含有表面活性剂，则可能需要进一步的平衡。

建议每10至20次分离后进行常规清洗，但清洗频率还取决于所用样品的性质。

去除严重污染

1. 改变流向。
2. 用4倍柱体积的1 M NaOH（以除去疏水性蛋白质或脂蛋白）清洗，然后用4倍柱体积的蒸馏水清洗。
3. 用0.5倍柱体积的30％异丙醇清洗以除去脂质和非常疏水的蛋白质，然后用2倍柱体积的蒸馏水洗涤。
4. 用至少5个柱体积的缓冲液平衡层析柱，或直至 A₂₈₀监测基线和洗脱液的pH值保持稳定，然后开始新的分离。

对于极端的污染情况，请查看产品随附的说明。