PAGE简介 — 基于分子大小的蛋白质分离

聚丙烯酰胺凝胶通过丙烯酰胺与双丙烯酰胺（N,N’-亚甲基双丙烯酰胺）的反应形成，产生高度交联的凝胶基质。凝胶充当筛子，蛋白质在电场作用下通过这个筛子。蛋白质总体带正电或负电，这使得蛋白质分子能够朝向等电点移动，在等电点分子没有净电荷。通过使蛋白质变性并赋予它们均匀的负电荷，可以在它们向正电极迁移时基于它们的大小分离它们。

图 1. 蛋白质样品和色同步蛋白标记物的SDS-PAGE（C1992）

实验方案

所需材料和试剂

• 包含电源、玻璃板、垫片和点样梳的垂直电泳室

所需试剂	试剂中的组分	货号
丙烯酰胺 / 双丙烯酰胺溶液	丙烯酰胺  29.2 g 双丙烯酰胺 0.8 g	01696 M7279
灌胶缓冲液	1.5M Tris-HCl，pH8.8（制备分离胶）： 将18.15 g Tris碱溶于80 mL蒸馏水中。 用6N HCl调节pH至8.8。 用蒸馏水将最终体积补足至100 mL。 0.5 M Tris-HCl，pH 6.8（制备积层胶）： 将6 g Tris碱溶于80 mL蒸馏水中。 用6N HCl调节pH至6.8。 用蒸馏水将最终体积补足至100 mL。	93362
2X Laemmli上样缓冲液：	溴苯酚蓝 0.004% 2-巯基乙醇 10% 丙三醇 20% SDS 4% Tris-HCl 0.125 M	B5525 M3148 G5516 L3771 93362
10X电泳缓冲液	Tris-HCl 25 mM 甘胺酸 200 mM SDS 0.1% (w/v)	93362 G8898 L3771
10% SDS	SDS	L3771
10% 过硫酸铵	过硫酸铵	A3678
TEMED	TEMED	T9281

注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺在性质上具有神经毒性。所有步骤均应佩戴无粉手套进行。

制备凝胶

• 用去离子水和乙醇清洁凝胶浇注装置的玻璃板和垫片。
• 将玻璃板和垫片组装在稳定、平整的表面上。
• 根据所需凝胶的百分比，使用以下体积制备分离凝胶溶液（制成体积为10 mL）。

凝胶%	水 (mL)	30% 丙烯酰胺 (mL)	1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (mL)	10% SDS (µL)	10% APS (µL)	TEMED*(µL)
8%	4.6	2.6	2.6	100	100	10
10%	3.8	3.4	2.6	100	100	10
12%	3.2	4.0	2.6	100	100	10
15%	2.2	5.0	2.6	100	100	10
* TEMED必须最后添加。

• 将凝胶溶液倒入组装了垫片的玻璃板中。为了使分离凝胶表面保持均匀和水平，用水或异丙醇（I9516）间隔表面。
  
• 让凝胶在室温下凝固约20-30分钟。
  
• 使用以下体积制备积层凝胶溶液（制成体积为10 mL）：
  

凝胶%	水 (mL)	30% 丙烯酰胺 (mL)	0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (mL)	10% SDS (µL)	10% APS (µL)	TEMED*(µL)
5%	5.86	1.34	2.6	100	100	10

* TEMED必须最后添加。

• 丢弃分离胶上的水。
• 加入5％积层胶溶液直至溢出。立即插入点样梳，确保凝胶中或梳齿周围没有气泡。
• 让凝胶在室温下凝固约20-30分钟。
  

样品制备

• 在一定体积的蛋白质样品（细胞或组织裂解液）中，加入等体积的上样缓冲液。
  
• 将上述混合物在95°C下煮沸5分钟，16000G离心5分钟。
  
• 这些样品可以在-20°C下储存，也可以用于进行凝胶电泳。

凝胶染色

考马斯蓝染色：用考马斯亮蓝R-250染色蛋白质凝胶是显示通过SDS-PAGE分离的蛋白质的常用方法。它非常灵敏，适合长期储存凝胶。

所需试剂

• 凝胶固定液 (500 mL)
  
       甲醇 (M3641) 250 mL
       冰醋酸 (695092) 50 mL
       水 200 mL
  
  
• 考马斯溶液
  
       CBB R-250 (B6529) 0.1%
       甲醇 (M3641) 40%
       冰醋酸 (695092) 10%
       使用Whatmann 1号滤纸过滤染色溶液。
  
  
• 脱色溶液
  
       甲醇 (M3641) 50 mL
       冰醋酸 (#695092) 35 mL
  
  
• 凝胶储存溶液
  
       冰醋酸 (695092) 25 mL
       水 475 mL

操作流程

• 电泳后，将凝胶放入含有凝胶固定溶液的塑料托盘中。将托盘放在摇床上固定蛋白质2小时。
  
• 丢弃凝胶固定溶液，然后加入考马斯溶液。  放在摇床上，将凝胶染色2-4小时。
  
• 染色步骤后，用蒸馏水洗涤凝胶数次，以去除多余的染料。
  
• 将脱色溶液添加到凝胶。放在摇床上脱色约4个小时，直到可以看到清晰背景上的清晰蓝色条纹。
  
• 脱色后，可将凝胶储存在凝胶储存溶液中，并根据需要拍照。

银染

我们提供适用于SDS-PAGE凝胶的高灵敏度蛋白质检测银染试剂盒。还需要以下试剂：

• 固定溶液
  
      乙醇(E7023) 50 mL
       醋酸
       水 40 mL
  
  
• 30% 乙醇（E7023）溶液

操作流程

• 电泳后，将凝胶浸入固定溶液40分钟。在固定溶液中浸泡过夜能产生更清晰的背景。
  
• 丢弃固定溶液，用30％乙醇溶液洗涤凝胶10分钟，然后用超纯水洗涤10分钟。
  
• 倒出水，并将凝胶在敏化剂溶液中孵育10分钟。
  
• 丢弃敏化剂溶液，用水洗涤凝胶两次，每次洗涤持续10分钟。
  
• 倒出水，并将凝胶浸泡在银溶液中10分钟。
  
• 倒掉银溶液，并在水中洗涤凝胶1.5分钟。
  
• 倒掉水，将凝胶浸入显影液中3至7分钟。
  
• 向显影液中加入5 mL终止液，孵育5分钟。丢弃显影液/终止液，在超纯水中洗涤凝胶15分钟。
  
• 这时凝胶可以拍照，也可以储存在新鲜的超纯水中。

双重染色：使用CBB R-250对凝胶进行染色，然后使用上述步骤进行银染色。

荧光染色：我们为蛋白质电泳提供荧光SYPRO和Lucy染色剂。可以在黑暗中将凝胶浸入荧光染色剂中，或者在电泳过程中将凝胶与阴极缓冲液混合。

染色实验方案取决于所使用的染色剂，可以在此处找到：

• SYPRO^® 宝石红蛋白质凝胶染色剂 (PDF)
  
• LUCY^® 506 溶液 (PDF)
  

可逆凝胶染色

可逆凝胶染色使用户能够在SDS-PAGE后进行蛋白质的蛋白质免疫印迹。

R-PROB染色：R-PROB是一种独特的染色剂，可用来检测PAGE凝胶和西方蛋白质印迹上的蛋白质。

所需试剂：

• 用于膜和聚丙烯酰胺凝胶的可逆蛋白质检测试剂盒（RPROB）
  
• 固定溶液（F7264）
  
• 10% 醋酸
  
• EDTA 50 mM

操作流程

• 将电泳后的凝胶浸入固定溶液中20分钟。重复此步骤两次。
  
• 在水中冲洗凝胶两次，每次冲洗持续30分钟。
  
• 将凝胶在染色溶液中孵育20-40分钟，同时轻轻搅拌。
  
• 用10％醋酸洗去多余的染色剂。
  
• 脱色：用EDTA洗涤凝胶，然后在水中或固定溶液中洗涤15分钟，洗两次。

铜染色：为了确认蛋白质的迁移和分离，凝胶可以用可逆染色剂（如CuCl₂）染色。

所需试剂

• 0.3 M CuCl₂溶液
  
• 0.25 M Tris和0.25 M EDTA溶液

操作流程

• 将电泳后的凝胶用蒸馏水冲洗最多30分钟。
  
• 将凝胶浸入0.3 M CuCl₂溶液中10分钟。
  
• 用去离子水冲洗。
  
• 蛋白质可以在蓝色背景上显示为清晰的区域。
  
• 脱色：反复在0.25 M Tris和0.25 M EDTA溶液（pH 9）中洗涤染色的凝胶。
  
• 在进行后续的转印操作之前，将脱色后的凝胶转移至转印缓冲液中。

图 2. 印迹和垂直电泳系统

如果需要在电泳后将蛋白质转印到膜上，在此处可以找到实验方案。

参考文献

1. Sambrook J, Fritsch T, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.