Descripción tecnológica general
Consideraciones analíticas
Métodos de cuantificación
Equipos y suministros
Guía de selección de mezclas para PCR
Protocolo
Resolución de problemas
Materiales
Referencias
Descripción tecnológica general: qPCR con SYBR Green
Con el desarrollo de los termocicladores que incorporan la detección fluorescente, la PCR tiene una aplicación nueva e innovadora. En la PCR convencional, el resultado fundamental es la cantidad final de amplicón generado después del proceso. La PCR en tiempo real o cuantitativa y la RT-PCR utilizan la linealidad de la amplificación del ADN para determinar las cantidades absolutas o relativas de una secuencia conocida en una muestra. Utilizando un reportero fluorescente en la reacción, es posible medir la generación del ADN.
Figura 1.Descripción tecnológica general qPCR con SYBR Green
En la PCR cuantitativa, la amplificación del ADN se supervisa en cada ciclo de PCR. Cuando el ADN se encuentra en la fase de amplificación logarítmica lineal, la cantidad de fluorescencia aumenta por encima del valor del fondo. El punto en el que la fluorescencia deviene medible se denomina ciclo de cuantificación (Cq) o punto de cruce o corte. Mediante el uso de múltiples diluciones de una cantidad conocida de ADN patrón, se puede generar una curva de calibración de log de la concentración frente al Cq. La cantidad de ADN o ADNc de una muestra desconocida puede calcularse después a partir de su valor Cq.
A) Las diferentes fases de la reacción:
Inicial: la concentración inicial de la plantilla es baja; por lo tanto, la intensidad de la fluorescencia es demasiado baja como para ser detectada y solo es evidente la señal de fondo.
Exponencial: después de que la producción de la diana ha alcanzado el umbral de detección, que se muestra como la línea umbral roja, el curso de la reacción puede seguirse a través de la fase exponencial.
Lineal: a medida que aumenta la concentración de la plantilla, se reduce la concentración de ADN polimerasa disponible y la velocidad de la reacción disminuye.
Meseta: no hay suficiente enzima libre como para continuar la amplificación, por lo que, después de este punto, la reacción está al máximo rendimiento, o la fase de meseta.
B) Las reacciones individuales se caracterizan por el ciclo en el que la fluorescencia se eleva por primera vez por encima del umbral, que se conoce como el Ciclo de cuantificación (Cq). Si el material de partida es abundante, la amplificación se observa en ciclos más tempranos y el Cq es menor. Si el material de partida es escaso, la amplificación se observa en los ciclos más tardíos y el Cq es mayor. Esta correlación entre la fluorescencia, Cq y la cantidad de producto amplificado permite cuantificar la plantilla en un amplio intervalo dinámico.
La PCR en tiempo real también se presta a estudios relativos. Puede realizarse una reacción utilizando cebadores únicos para cada región que se amplificarán y etiquetarán con diferentes colorantes fluorescentes. Varios termocicladores cuantitativos comercializados incluyen múltiples canales de detección. En este sistema múltiple, la cantidad de ADN o ADNc diana se puede comparar con la cantidad de una secuencia constitutiva, por ejemplo, GAPDH o β-actina.
NR= no recomendado
X= recomendado
XX= método preferido
Consideraciones sobre el análisis
Preparación del ADN
El paso más importante para asegurar el éxito con la PCR es la preparación de un ADN de alta calidad. La integridad y la pureza de la plantilla de ADN son esenciales. La PCR cuantitativa implica rondas múltiples de reacciones enzimáticas y, por consiguiente, es más sensible a impurezas como proteínas, fenol/cloroformo, sales, EDTA y otros disolventes químicos. Los contaminantes también pueden interferir en la detección de la fluorescencia. El cociente de los valores de absorbancia a 260 nm y 280 nm proporciona una estimación de la pureza del ADN. El ADN puro tiene un cociente A260/A280 de 1,8-2,0. Cocientes inferiores indican la presencia de contaminantes, como las proteínas.
Plantilla
Se necesitan muy pocas copias del ácido nucleico diana (el equivalente a aproximadamente 100 pg de ADN genómico (ADNg) o ADNc) para iniciar la qPCR. Para reducir al mínimo la contaminación con inhibidores de reacción, la cantidad de plantilla inicial debe mantenerse al mínimo exigido para lograr una cuantificación precisa. Cuando el material de partida es ARN, el diseño del cebador y el tratamiento con ADNasa I reducirán las señales que pueden generarse por la contaminación con ADNg.
Diseño del cebador
Ya sea utilizando un colorante de unión a un ADN bicatenario o una química de detección basada en sondas, el diseño de cebadores de gran calidad es uno de los pasos preexperimentales más cruciales en la qPCR. Los cebadores específicos para la PCR deben diseñarse con la ayuda de un software de diseño de cebadores para eliminar las complicaciones introducidas con los dímeros de cebador y las estructuras secundarias. Las concentraciones de cebadores más bajas disminuyen la acumulación de formación de dímeros de cebador y la formación de productos inespecíficos, lo cual es crucial cuando se utiliza el colorante SYBR Green I en la PCR cuantitativa.
Trifosfatos de desoxinucleótido (dNTP)
Las mezclas maestras convencionales para PCR/qPCR contienen dATP, dCTP, dGTP y dTTP. Sin embargo, existen algunas mezclas en las que el dTTP se sustituye por el dUTP. Los productos de las reacciones anteriores ejecutadas con dUTP contendrán uracilo en lugar de timina y serán susceptibles de experimentar escisión por la uracil-ADN-glucosilasa (UNG). Por tanto, la incubación anterior de las reacciones subsiguientes con UNG evita la contaminación por arrastre entre reacciones. Para que sean eficaces, se debe utilizar dUTP en todas las reacciones en el laboratorio.
Concentración de magnesio
El cloruro de magnesio (MgCl2) es necesario para la actividad transcriptasa inversa, ADN polimerasa Taq y ADN Taq 5’ a 3’ exonucleasa. Las concentraciones óptimas de Mg2+ para reacciones que contienen DLP suelen oscilar entre 3 y 6 mM. Menores concentraciones de cloruro de magnesio suelen dar como resultado la formación de menos productos inespecíficos. Algunas disoluciones de mezclas de reacción preparadas (ReadyMix) se suministran a una concentración dos veces mayor de cloruro de magnesio 7 mM (concentración final 3,5 mM). En algunos casos, se proporciona un vial de una disolución de cloruro de magnesio 25 mM para una ulterior optimización de la concentración final de cloruro de magnesio si es necesario. A veces, puede requerirse una mezcla de reacción que no contenga MgCl2 para poder utilizar una concentración baja, por ejemplo, cuando se utiliza la detección con una sonda Scorpion.
Transcriptasa inversa
Una enzima transcriptasa inversa que proporciona altos rendimientos de ADNc, a la vez que conserva su actividad a elevada temperatura, es fundamental para el éxito de la RT-qPCR. El rendimiento a elevadas temperaturas contribuye a garantizar que las regiones de ARN con significativa estructura secundaria estén desestabilizadas y sean accesibles para la hibridación y la amplificación posterior. Al realizar la RT-qPCR de un solo paso, el rendimiento a altas temperaturas permite el uso de cebadores específicos de gen con elevadas temperaturas de fusión (Tm), lo que aumenta la especificidad de la reacción. Cuando se realizan protocolos de dos pasos, es importante asegurarse de que la enzima produzca un rendimiento lineal y proporcional de ADNc a partir del ARN. Minimizar el pipeteo puede disminuir la variabilidad. Algunas ReadyMixes contienen cebadores y otros reactivos necesarios para realizar la transcripción inversa (RT), por ejemplo, la mezcla de síntesis de ADNc ReadyScript® (RDRT).
ADN polimerasa Taq
Al igual que ocurre con la selección de la transcriptasa inversa más adecuada para la RT, la selección de la enzima adecuada es vital. Un problema fundamental con la ADN polimerasa Taq natural es que la enzima tiene actividad residual a baja temperatura. La unión inespecífica al cebador induce la formación de productos inespecíficos como consecuencia de esta actividad polimerasa residual. Las ADN polimerasas Taq bloqueadas con anticuerpos o químicamente (“inicio en caliente”) contribuyen a rectificar esta situación al evitar la actividad enzimática hasta que comience el paso de desnaturalización a elevada temperatura. Consulte la Guía de selección de mezclas de PCR para definir la mejor polimerasa de inicio en caliente para su aplicación.
Colorante de referencia interna por tipo de equipo
Algunos termocicladores de PCR en tiempo real requieren un colorante de carga, como ROX, para controlar la variabilidad en el sistema óptico y normalizar las diferencias en la intensidad de la señal. De igual modo, algunos termocicladores requieren fluoresceína para crear un fondo virtual cuando se trabaja con colorante SYBR Green I (que tiene un fondo muy bajo). Pueden suministrarse en la mezcla ReadyMix o como componentes independientes para poder utilizar la concentración adecuada. En algunos casos, se incluye un vial de colorante de referencia interna para la normalización de la reacción. La excitación máxima de este colorante es a 586 nm y la emisión máxima es a 605 nm. Los ajustes estándar del instrumento para el colorante de referencia ROX son satisfactorios para la medición del colorante de referencia interna. Este colorante de referencia interna es necesario para los sistemas de detección de secuencias ABI.
Equipos
Hay que seleccionar reactivos compatibles con los instrumentos. En las plataformas se utilizan diferentes colorantes de normalización; por tanto, habrá que seleccionar reactivos con colorantes de normalización compatibles (consúltese el Anexo 1).
Muchos equipos de qPCR se han diseñado para admitir una gama específica de aplicaciones, por ejemplo, compárese la capacidad de alto rendimiento del ABI 7900 utilizando la carga automática de placas de 384 pocillos con el instrumento Illumina Eco que admite una única placa de 48 pocillos. El instrumento más adecuado satisface las necesidades de la investigación. Lo deseable es seleccionar un instrumento con un software fácil de usar que realice las funciones deseadas y tenga flexibilidad en cuanto a la salida de datos de modo que puedan manipularse fácilmente en paquetes de software de análisis estadístico a continuación. Esto reduce el tiempo necesario para capacitar al personal y por lo tanto comenzar a generar resultados. Otras características que se requieren son un bloque de PCR absolutamente uniforme (una desviación máxima absoluta de 1Cq= 2 veces en 96 pocillos de replicación) y un sistema óptico que se excite y detecte la emisión de la manera más sensible y uniforme posible en una amplia gama de longitudes de onda. Esto permite una amplia selección de fluoróforos y hace posible la multiplexación. Otras características que deben considerarse son los costes de funcionamiento asociados a fungibles específicos, por ejemplo, si no se utiliza una placa de microvaloración estándar para reacciones y también la conveniencia de cargar placas o tubos que no sean de formato estándar.
Controles
Un control positivo siempre es útil para asegurarse de que todos los componentes del kit funcionan correctamente. Es necesario un control sin plantilla, o negativo, para determinar si hay contaminación. Una señal en el control sin plantilla demuestra la presencia de contaminación de ADN o formación de dímeros de cebador.
Disolución tampón
Los tampones o las mezclas maestras de reacción suelen contener los dNTP, una ADN polimerasa Taq, MgCl2 y estabilizadores. También se pueden incluir SYBR Green I, ROX™, fluoresceína y colorantes de carga inertes, dependiendo de la química de detección, el instrumento y los requisitos de la reacción. Los componentes y estabilizadores del tampón de PCR suelen ser propiedad del fabricante. Si se compran por separado, es posible la máxima flexibilidad, ya que cada ingrediente se puede optimizar individualmente en la reacción. Por el contrario, si bien la compra de los ingredientes juntos como mezcla maestra reduce la flexibilidad, aumenta la uniformidad del lote y la comodidad, al tiempo que reduce el número de pasos de pipeteo y, por lo tanto, las posibilidades de error y contaminación.
Análisis de los datos
Siga las recomendaciones del equipo de PCR en tiempo real utilizado para realizar la PCR cuantitativa con SYBR Green. Lo siguiente puede ayudar a los nuevos usuarios de instrumentos. Generalmente se representa el número de ciclos contra la fluorescencia. Los ciclos umbral (CTs) o puntos de cruce se utilizan para determinar la cantidad de plantilla en cada muestra. El ciclo umbral o punto de cruce es el primer ciclo en el que se observa un aumento detectable de la fluorescencia debido a la formación de productos en la PCR. Los ciclos anteriores al punto de cruce son los ciclos basales. En los ciclos basales no se observa un aumento detectable de la fluorescencia por los productos de la PCR. El umbral utilizado para determinar cuándo se produce el primer aumento detectable de fluorescencia también se puede ajustar manualmente. El umbral debe marcarse siempre en un gráfico de amplificación logarítmico. En un gráfico de amplificación logarítmico, el umbral debe establecerse en el intervalo logarítmico lineal y no en la fase meseta.
Curvas de fusión
La realización de un análisis de la curva de fusión al final del ciclo ayudará a analizar sólo el producto de interés de la PCR. Siga las instrucciones del fabricante del equipo en tiempo real para analizar la curva de fusión. Pueden modificarse los ciclos sucesivos con los mismos cebadores para eliminar la contribución de la formación de dímeros del cebador a la señal del producto mediante la recopilación de datos en otro paso de ciclado, cuya temperatura debe estar entre la temperatura del dímero ya determinada y la de fusión del producto (TM).
Métodos de cuantificación
Curvas de calibración
Las curvas estándar o de calibración son necesarias para la cuantificación absoluta y la relativa. Al generar curvas estándar, deben utilizarse diferentes concentraciones de ADN (normalmente cinco) para generar una curva de calibración que contenga la concentración desconocida. Cada concentración se debe ejecutar por duplicado.
Cuantificación absoluta y relativa
Este kit SYBR Green PCR se puede utilizar para cuantificar el ADN diana utilizando cuantificación absoluta o relativa. Las técnicas de cuantificación absoluta se utilizan para determinar la cantidad de ADN diana en la muestra inicial, mientras que la cuantificación relativa determina el cociente entre la cantidad de ADN diana y un amplicón de referencia. El amplicón de referencia ideal tendría una expresión constitutiva no variable. En la práctica, se elige un gen constitutivo para esta función, pero hay otras opciones de referencia que cumplen mejor los requisitos anteriores.
En la cuantificación absoluta se utilizan patrones externos para determinar la cantidad absoluta del ácido nucleico de interés. Para eliminar las diferencias en la cuantificación debidas a la hibridación, los sitios de unión al cebador de los patrones externos deben ser los mismos que los de la secuencia diana. El patrón externo ideal contiene secuencias que son iguales a la secuencia de interés o que varían solo ligeramente con respecto a la secuencia de interés. Para la cuantificación absoluta se requieren rendimientos de amplificación equivalentes entre la diana y el patrón externo. Una vez identificado un constructo o amplicón adecuado, se genera una curva de calibración con diluciones del patrón externo y se utiliza para determinar las concentraciones de muestras diana desconocidas.
La cuantificación relativa permite calcular el cociente entre la cantidad de plantilla diana y una plantilla de referencia en una muestra. Dado que este método mide la cantidad de diana con respecto a un control presuntamente invariable, la qPCR relativa se suele utilizar con mayor frecuencia para medir diferencias de polimorfismo genético, por ejemplo, entre tejidos o entre muestras sanas y enfermas. La ventaja de esta técnica es que la utilización de un patrón interno puede reducir las variaciones en la preparación y la manipulación de la muestra al mínimo. Cuando se utilizan sistemas SYBR, la cuantificación de la diana y de la referencia interna debe realizarse en reacciones separadas.
La precisión de la cuantificación relativa depende de la elección adecuada de una plantilla de referencia para los patrones. La variabilidad del patrón influirá en los resultados, por lo que es muy importante que los patrones sean apropiados.1 Algunos investigadores optan por no elaborar una curva de calibración e informar las cantidades de diana como una fracción de la referencia, una técnica denominada cuantificación comparativa. Alternativamente, se puede suponer que los rendimientos de amplificación de la diana y la referencia son insignificantes y cuantificar la diana basándose únicamente en la curva de calibración determinada para la secuencia de referencia. Por último, en la más precisa de las técnicas de cuantificación relativa, se miden los rendimientos de amplificación tanto de la referencia como de la diana, y se determina un factor de corrección. Este proceso, denominado normalización,1 requiere una muestra que contenga concentraciones conocidas tanto de la diana como de la referencia, así como la generación de dos curvas de calibración.
Determinación de los rendimientos de la reacción de PCR
El rendimiento de la PCR entre una muestra de referencia y una muestra de diana se determina mediante la preparación de una dilución en serie para cada diana. Los valores de CT de la referencia se restan de la diana y esta diferencia en los valores de CT se representa contra el logaritmo de la cantidad de plantilla. Si la pendiente resultante de la línea recta es inferior a ± 0,1, las eficiencias de amplificación se consideran similares.
Equipo
- Equipo de PCR cuantitativa
- Microcentrífuga
- Campana de flujo laminar para configuración de la PCR (opcional)
Materiales
- Mezcla para qPCR SYBR Green Mix – Consúltense las Guías de selección par qPCR (Parte 1yParte 2)
- Plantilla de ADN/ADNc: reacción del ADNc diluida 1:10 para detectar dianas de expresión media a alta o 1:2 a 1:5 para transcriptos raros o de 10 ng a 100 ng de ADN genómico (ADNg)
- Cebadores directos e inversos diluidos a la concentración de trabajo (reservas de trabajo 10 µM son suficientes para la mayoría de los análisis)
- También se dispone de cebadores de expresión génica prediseñados para la mayoría de los microorganismos modelo (Cebadores KiCqStart®SYBR®Green,KSPQ12012)
- Puntas de pipeta con filtro estériles
- Tubos de microcentrífuga estériles con tapón de rosca de 1,5 ml (como CLS430909)
- Tubos de PCR; seleccione los tubos para que coincidan con el formato deseado:
- Tubos individuales de PCR de 200 µl de pared fina (Z374873 o P3114)
- Placas
- Placas de 96 pocillos (Z374903)
- Placas de 384 pocillos (Z374911)
- Juntas de placa
- Películas de sellado ThermalSeal RTS™ (Z734438)
- Película ThermalSeal RT2RR™ (Z722553)
- Agua de calidad para PCR (W1754)
Protocolo
Preparación
- Coloque en hielo todos los componentes de la reacción.
- Mezcle y luego centrifugue brevemente para recoger el contenido en el fondo del tubo.
Reacción del colorante SYBR Green I patrón
Nota: hemos observado que los ensayos realizados en KiCqStart ReadyMix son óptimos cuando se utiliza una concentración de cebador más alta que en la PCR convencional. En los protocolos siguientes, utilizamos una concentración final de 450 nM, que hemos observado que es la concentración óptima para varios ensayos independientes.
1. Prepare mezcla maestra suficiente como para procesar todas las muestras por duplicado.
a. Asegúrese de incluir controles negativos sin plantilla (NTC) por duplicado.
b. Seleccione la tabla adecuada de las siguientes en función del reactivo para qPCR seleccionado.
c. Calcule la cantidad de reactivos que hay que mezclar. Añada un volumen del 10 % para permitir el error de pipeteo
d. Mezcle bien, evitando la aparición de burbujas.
Mezcla maestra para reactivos KiCqStart:
Mezcla maestra de otras ReadyMixes completas para qPCR:
Mezcla maestra para reactivos de qPCR con componentes separados:
1La concentración óptima de MgCl2puede oscilar entre 1mM y 6mM.
2Para determinar la concentración óptima del colorante de referencia para su instrumento consulte el Anexo 1
2. Reacciones de configuración:
a. Para las reacciones NTC (controles negativos sin plantilla), añada 4 μl de agua al tubo de reacción.
b. Para reacciones experimentales, añada 4 μl de disolución de ADNc al tubo de reacción.
c. Centrifugue todos los tubos brevemente. Confirme visualmente que todos los tubos o pocillos contienen el volumen correcto de muestra en el fondo .
d. Distribuya cuidadosamente 16 μl de mezcla maestra de la plantilla en cada tubo o pocillo de placa de qPCR.
e. Mezcle bien las reacciones y centrifugue si es necesario.
f. Tape los tubos o precinte la placa de PCR y ponga la etiqueta (según los requisitos del instrumento). (Asegúrese de que la etiqueta no obstruya la trayectoria de la luz de excitación/detección del instrumento.)
3. Procese las muestras según las recomendaciones del fabricante del instrumento. A continuación se indican ejemplos de ciclados estándar y rápidos.
Parámetros de ciclado estándar:
Parámetros de ciclado rápido:
Nota: utilice el protocolo estándar de curva de disociación (recopilación de datos).
4. Consulte las instrucciones sobre cómo analizar los datos en el manual del instrumento.
Anexo 1
Concentraciones de colorante de referencia recomendadas para su uso con instrumentos. Para reactivos de qPCR con un colorante de referencia separado
Guía de resolución de problemas
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