Protocolo de hibridación de oligonucleótidos

• Abbreviations
• Equipo y suministros para hibridación ADN / ARN
• Método de hibridación ADN / ARN
• Recetas de disoluciones tampón para hibridación del ADN

Este protocolo sirve para hibridar dos oligonucleótidos monocatenarios con secuencias complementarias (Figura 1). El calentamiento seguido de enfriamiento facilita la hibridación.

Figura 1. Ejemplo de una reacción de hibridación. El calor “rompe” todos los enlaces de hidrógeno, alterando así cualquier estructura secundaria dentro de cada oligonucleótido. El enfriamiento lento facilita luego la hibridación a medida que se forman nuevos enlaces de hidrógeno entre las secuencias complementarias.

Definiciones / Abreviaturas

EDTA: Ácido etilenodiaminotetraacético.

NaCl: Cloruro de sodio

Base Trizma^®: Nombre comercial de Tris [Tris(hidroximetil)aminometano]

Oligo: Abreviatura de oligonucleótido u oligómero. Los oligonucleótidos son moléculas cortas de ADN o ARN monocatenario que deben hibridarse (calentarse o fundirse) para que puedan unirse y formar una doble hebra con una cadena de ADN o ARN complementaria apropiada.

Hibridación del ADN: En esta página se describe el proceso de hibridación de todos los oligonucleótidos. A veces el proceso se conoce como hibridación del ADN, aunque se utilice también para el ARN. La hibridación se produce mediante el calentamiento y el enfriamiento de dos oligonucleótidos monocatenarios con secuencias complementarias. El calor rompe todos los enlaces de hidrógeno y el enfriamiento permite que se formen nuevos enlaces entre las secuencias.

Equipo y suministros para hibridación ADN / ARN

• Bloque calefactor o termociclador
• Tubos de centrífuga de 2 ml
• Puntas de pipeta
• H₂O Milli-Q^®
• EDTA (nº de referencia  E9884)
• NaCl (nº de referencia  S3014)
• Base Trizma^®(nº de referencia  93362)
• Dos oligonucleótidos monocatenarios con secuencias complementarias

Método de hibridación ADN / ARN

El proceso de hibridación se divide en dos etapas principales: 1) disolución y 2) hibridación, ya sea por bloque calefactor o en termociclador.

Disolución del oligo

Cada oligonucleótido viene en una cantidad medida, pero para obtener mejores resultados, compruébelo con un espectrofotómetro para asegurarse de añadir cantidades iguales de cada oligonucleótido a la reacción.

• Disuelva cada oligonucleótido en un volumen de tampón de hibridación (consulte las recetas de disoluciones tampón a continuación) para que tengan todos la misma concentración.
• La concentración de cada oligonucleótido debe ser el doble de la concentración deseada del oligonucleótido dúplex.

Ejemplo

La concentración deseada del oligonucleótido dúplex es 50 µM.

1. Oligonucleótido 1: suministrado con 10,55 de DO (312,6 µg, 49,9 nmol); verifique la cantidad de DO medida con el espectrofotómetro.
2. Oligonucleótido 2: suministrado con 9,04 de DO (279,7 µg, 45,9 nmol); verifique la cantidad de DO medida con el espectrofotómetro.
3. Cada disolución madre de oligonucleótido debe tener el doble de la concentración de oligonucleótido dúplex deseada, es decir, cada disolución madre debe ser de 100 µM.
   1. Para el oligonucleótido 1, añada 49,9 x 10 = 499 µl de tampón de hibridación para crear una disolución madre de 100 µM.
   2. Para el oligonucleótido 2, añada 45,9 x 10 = 459 µl de tampón de hibridación para crear una disolución madre de 100 µM.

*Este cálculo es un atajo que solo funciona para crear disoluciones de 100 µM y se utiliza aquí solo como ejemplo. Para obtener más información sobre el cálculo de diferentes concentraciones de oligonucleótidos, véase Directrices de manipulación y estabilidad.

Hibridación de oligonucleótidos

Bloque calefactor

1. Mezcle volúmenes iguales de oligonucleótidos equimolares en un microtubo.
2. Incube el microtubo a 95 °C durante 5 minutos.
3. Deje que el microtubo se enfríe lentamente a temperatura ambiente (<60 min).

Termociclador

Aunque un bloque calefactor funcionará, un termociclador permite un proceso más estable.

1. Mezcle volúmenes iguales de los oligonucleótidos equimolares en un tubo de PCR.
2. Utilice el siguiente perfil térmico:
   1. Calentar hasta 95 °C y mantener la temperatura durante 2 minutos.
      
   2. Enfriar a 25 °C durante 45 minutos.
      
   3. Enfriar a 4 °C para almacenamiento temporal.
3. Centrifugue brevemente el tubo de PCR para eliminar toda la humedad de la tapa.

Tras la retirada del bloque calefactor o el termociclador, el oligonucleótido dúplex está listo para ser utilizado o almacenado. Para obtener más información sobre la conservación de los oligonucleótidos, véase Directrices de manipulación y estabilidad.

Recetas de disoluciones tampón para hibridación del DNA

Prepare todos los tampones con agua Milli-Q^®.

Composición del tampón de hibridación (X1)

• Tris 10 mM, pH 7,5 - 8,0
• NaCl 50 mM
• EDTA 1 mM

Composición del tampón de ligasa (X1)

Este tampón se utiliza normalmente con la ADN ligasa T4.

• Tris-HCl 50mM, pH 7,5
• MgCl₂ 10mM
• ATP 1mM
• DTT 10 mM

Composición del tampón de cinasa (X1)

Este tampón se utiliza normalmente con la polinucleótido cinasa T4.

• Tris-HCl 70mM, pH 7,6
• MgCl₂ 10mM
• DTT 5 mM