Preparación de bancos de NGS

Kits de extracción del ADN genómico

Para la preparación de los bancos de ADN, es necesario extraer ADN genómico (ADNg) de elevado peso molecular de las células, los tejidos u otros tipos de muestras. El ADN genómico purificado debe tener un mínimo de cizallamiento y contaminantes biológicos y químicos para obtener un rendimiento óptimo en las reacciones de amplificación o secuenciación subsiguientes.  

El kit de extracción de ADN de elevado peso molecular Fire Monkey™/Fire Flower™ permite el aislamiento de ADN genómico de gran pureza con un mínimo de cizallamiento y de ácidos nucleicos de bajo peso molecular contaminantes.

• Fire Monkey™ es un proceso convencional de columna de centrifugación que extrae ADN de elevado peso molecular con longitudes de hebra promedio de >100 kb de células bacterianas o de mamífero en 1 hora.
• Fire Flower™ es un proceso convencional de columna de centrifugación que puede seleccionar el tamaño del ADN extraído de una muestra de cualquier origen en un plazo de 15 minutos. Fire Flower™ puede aumentar la longitud promedio general de la cadena en un 30 % mientras que reduce los fragmentos de ADN de hasta 30 kb. 

Kits de amplificación del genoma completo

El análisis de la secuencia de ADN suele estar limitado por las pequeñas cantidades disponibles de la muestra o por un bajo rendimiento de la extracción. Cuando se dispone de material de partida limitado, pueden utilizarse técnicas de amplificación para aumentar la cantidad de ADN inicial. La amplificación del genoma completo (WGA) puede utilizarse para preamplificar muestras de ADN intactas y muy fragmentadas para su entrada en procedimientos de NGS.

El  kit SeqPlex-i WGA permite la amplificación de pequeñas cantidades de ADN o de ADN degradado o muy fragmentado para la entrada directa en las células de flujo de secuenciación masiva (NGS) Illumina®.  

• Facilita la secuenciación a partir de tan sólo 100 pg de ADN
• Cebadores mejorados para una cobertura completa del genoma, un sesgo de secuencia mínimo y el tamaño del amplicón ideal para la secuenciación de última generación (NGS)
• Rentable: Sin paso añadido de preparación del banco de NGS
• Compatible con la secuenciación masiva Illumina^®

El kit de amplificación mejorada del ADN SeqPlex para la amplificación del genoma completo está diseñado para facilitar la secuenciación masiva a partir de cantidades extremadamente pequeñas o de ADN degradado o muy fragmentado. Este kit se ha desarrollado para integrarse en los procesos de secuenciación Illumina^®, SOLID™ o 454.

• La tecnología de cebado aleatorio amplifica el ADN fragmentado como CHIP o FFPE
• Facilita la secuenciación a partir de tan sólo 100 pg de ChIP DNA
• Cebadores mejorados para una cobertura completa del genoma, un sesgo de secuencia mínimo y la eliminación de los cebadores
• Compatible con la preparación del banco Illumina^®, SOLID™ o 454 para la secuenciación masiva, o de última generación

Kits de - amplificación del - transcriptoma completo

El objetivo principal en la preparación de un banco de NGS para secuenciación del ARN es maximizar la complejidad del banco de transcriptomas para representar por completo la combinación de partida de secuencias, al tiempo que se reduce el sesgo. La secuenciación del ARN para el perfilado de la expresión génica de alto rendimiento y el análisis del transcriptoma suele resultar complicado por las bajas cantidades de ARN inicial. La amplificación del transcriptoma completo (WTA) puede utilizarse para generar cantidades suficientes de objetivos de secuenciación a partir de pequeñas cantidades de ARN, pero requiere una replicación de alta fidelidad del transcrito sin pérdida ni distorsión de los ARNm específicos para reducir el sesgo del banco.

El  kit SeqPlex-i WTA permite la amplificación de pequeñas cantidades de ARN obtenido mediante transcripción inversa o de ARN degradado para la entrada directa en las células de flujo de secuenciación masiva (NGS) Illumina®. 

• Amplifica cantidades fragmentadas o extremadamente pequeñas de ARN total. El ARN fragmentado o intacto de todas las procedencias, incluidas FFPE y RIP, se amplifica fácilmente utilizando tecnología de cebado aleatorio.
• El diseño del cebador semidegenerado del banco garantiza una cobertura más completa del transcriptoma y un cebado eficiente
• Menos pasos: No es necesario fragmentar el ADNc antes de la secuenciación
• Gran eficiencia: Amplifica el ADNc bicatenario en 8 horas o menos
• Rentable: Ya no se precisa una etapa añadida de preparación del banco de NGS
• Compatible con la secuenciación masiva Illumina^®

El kit de amplificación de ARN SeqPlex para la amplificación del transcriptoma completo (WTA) está diseñado para facilitar la secuenciación de última generación (NGS) a partir de pequeñas cantidades o de ARN degradado o muy fragmentado (por ejemplo, ARN de muestras de tejido incluidas en parafina y fijadas en formol (FFPE)). El kit SeqPlex permite al usuario preamplificar muestras de ARN para su entrada en un procedimiento de NGS.

• La tecnología de cebado aleatorio amplifica cantidades pequeñas de ARN fragmentado o intacto de todas las procedencias, como FFPE y RIP.
• Diseño del cebador semidegenerado del banco para una cobertura más completa del transcriptoma y un cebado eficiente.
• No es necesario fragmentar el DNA antes de la secuenciación.
• Amplifica el ADNc bicatenario en 8 horas o menos.
• Compatible con todas las plataformas de secuenciación masiva, excepto Pacific Bioscience.

Preparación de - bancos de - ARN pequeño

Las tecnologías de NGS han revolucionado el estudio de los ARN pequeños, como el miRNA, el siRNA y el piRNA, que han demostrado desempeñar un papel vital en la regulación postraduccional de la expresión génica. La secuenciación de ARN pequeño es un enfoque cada vez más popular en el descubrimiento y el perfilado de ARN pequeño. Sin embargo, los métodos de preparación de bancos de ARN pequeño pueden introducir un sesgo significativo, específicamente durante los pasos de ligadura al adaptador. 

El kit de preparación de bancos de ARN RealSeq^®-AC ofrece un nuevo método para preparar colecciones de secuenciación de miRNA y de ARN pequeño que reduce el sesgo de incorporación en la NGS. Mediante el uso de un nuevo adaptador único y de circularización, RealSeq^® reduce en gran medida el sesgo de preparación del banco. Esta tecnología resuelve el problema de las preparaciones de bancos de secuenciación de uso común que conducen a la infradetección de muchos miRNA.

• Reduce significativamente el sesgo de secuenciación en la secuenciación de ARN pequeño
• Cuantifica con precisión los ARN pequeños biológicamente significativos
• Permite el descubrimiento más eficaz de nuevos ARN pequeños

Limpieza de los bancos

La limpieza de los bancos de NGS implica la eliminación de adaptadores de secuenciación, cebadores de PCR, dNTP, enzimas y contaminantes amortiguadores, al tiempo que permite la selección de ácidos nucleicos que se encuentran en el intervalo de tamaños correcto para la secuenciación posterior. Los métodos de limpieza deben maximizar el rendimiento y la recuperación, minimizar la presencia de contaminantes biológicos y químicos, y eliminar fragmentos de ácidos nucleicos o moléculas del banco no deseados en preparación para la secuenciación.

El sistema de limpieza para PCR HighPrep™ es un reactivo de limpieza pos-PCR basado en microesferas paramagnéticas diseñado para la purificación eficaz de fragmentos de ADN y para la selección de amplicones de tamaño específicos. La purificación consiste en la eliminación de sales, cebadores, dímeros de cebador, dNTP, ya que los fragmentos de ADN se unen selectivamente a las microesferas magnéticas. Las microesferas magnéticas se utilizan para diferentes compuestos químicos de preparación del banco de NGS.

• Gran recuperación de amplicones >100 pb
• Adaptable a sistemas de manipulación de líquidos de alto rendimiento
• Recuperación estable de amplicones > 100 pb, selección de tamaño predecible y uniforme
• La ausencia de centrifugación o filtración produce rendimientos mayores y más puros