Concentration rapide d'anticorps avec les filtres à centrifuger Amicon^® Ultra

Introduction

Les protocoles de purification d'immunoglobulines incluent généralement une fixation par affinité sur un média de chromatographie avec protéine A ou G, un lavage des protéines non liées et une élution avec un tampon à pH faible. Les anticorps purifiés ainsi obtenus sont souvent trop dilués pour les études downstream ou une conservation à long terme. Une dialyse est souvent nécessaire pour concentrer l'anticorps et/ou remplacer le tampon par un autre capable de préserver l'activité des protéines. L'ultrafiltration permet d'atteindre plus rapidement le même résultat, en récupérant jusqu'à 99 % des immunoglobulines et en éliminant les sels en une seule étape (voir le protocole de concentration, dessalage et échange de tampon).

Méthode et résultats

Purification et concentration d'IgG de lapin avec les kits de purification d'anticorps Montage^® avec Prosep^® A et Prosep^® G et les filtres à centrifuger Amicon^® Ultra de 15 ml.

A. Purification de l'IgG avec les kits Montage^®

1. Équilibrer les résines Prosep^® A ou Prosep^® G avec 10 ml de tampon de liaison et centrifuger pendant 5 min à 500 × g.
2. Pré-clarifier l'échantillon de sérum en le passant sur une unité de filtration Steriflip^®-GP de 0,22 µm.
3. Diluer l'échantillon avec du tampon de liaison A selon un rapport de 1/1 et centrifuger le dispositif à 100-150 × g pendant 20 min.
4. Laver la colonne de centrifugation avec 20 ml de tampon de liaison A pour éliminer les contaminants non liés en centrifugeant la colonne pendant 5 min à 500 × g.
5. Éluer les échantillons en ajoutant 10 ml de tampon d'élution B2 dans un tube à centrifuger neuf contenant 1,3 ml de tampon de neutralisation.
6. Mesurer la concentration en protéines totales de l'échantillon selon une méthode appropriée, telle que l'absorbance UV à 280 nm.

B. Concentration de l'IgG avec les dispositifs Amicon^® Ultra-15 avec MWCO de 30 kDa

1. Verser la fraction éluée neutralisée dans un dispositif Amicon^® Ultra de 15 ml avec un MWCO de 30 kDa.
2. Centrifuger pendant 10 à 20 min à 4000 × g sur un rotor à godets mobiles ou à 5000 × g sur un rotor à angle fixe jusqu'à ce que l'échantillon atteigne la concentration désirée.