Dispositif automatisé d'électrophorèse 2D sur gel Auto2D^®

Comment fonctionne l'électrophorèse 2D sur gel ? Les techniques unidimensionnelles d'électrophorèse sur gel des protéines telles que SDS-PAGE sont couramment employées en laboratoire, mais elles offrent une faible capacité de séparation. L'électrophorèse bidimensionnelle sur gel (2-DE) sépare les protéines au sein d'échantillons complexes en fonction de la valeur pl et du poids moléculaire, permettant ainsi la comparaison directe et simultanée de centaines ou de milliers de protéines avec une haute résolution. Lorsqu'elle est associée à un logiciel d'analyse, à l'immunodétection ou à la spectrométrie de masse, la 2-DE est un outil puissant qui facilite l'identification des protéines et d'autres analyses protéomiques. Pour obtenir des ressources et des produits supplémentaires, consultez notre page Électrophorèse des protéines et western blotting.

• Électrophorèse 2D sur gel entièrement automatisée
• Comment analyser un gel 2D à l'aide du dispositif d'électrophorèse 2D Auto2D^® ?
• Pourquoi utiliser l'électrophorèse 2D sur gel ?
• Mesure des HCP résiduelles dans les produits biopharmaceutiques
• Systèmes Auto2D^® destinés à valider les anticorps anti-HCP pour les dosages immuno-enzymatiques ELISA et autres
• Reproductibilité élevée du système Auto2D^®
• Système Auto2D^® pour le profilage des antigènes
• Système Auto2D^® pour la conformité réglementaire

 

Électrophorèse 2D sur gel entièrement automatisée

On considère généralement que l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel est une technique longue et difficile à réaliser qui nécessite une formation avancée, pour une faible reproductibilité et une grande variabilité interopérateur. Le système Auto2D^® automatise entièrement l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel. L'échantillon pénètre passivement dans le gel de première dimension, et les protéines sont séparées selon leurs points isoélectriques. Après l'équilibrage, le gel de première dimension est placé sur un gel SDS-PAGE horizontal qui sépare les protéines en fonction de leur poids moléculaire. Le dispositif convivial d'électrophorèse 2D Auto2D^® permet une électrophorèse bidimensionnelle en 1-2 heures pour des résultats plus rapides et reproductibles. Autres caractéristiques et avantages du dispositif d'électrophorèse 2D Auto2D^® :

• Facilité d'utilisation : ne nécessite aucune formation avancée
• Mise en œuvre rapide pour limiter les périodes d'immobilisation du laboratoire
• Variabilité interopérateurs réduite et reproductibilité accrue
• Support à la QI/QO pour la conformité aux BPF

Comment analyser un gel 2D à l'aide du dispositif d'électrophorèse 2D Auto2D^® ?

Le dispositif d'électrophorèse 2D Auto2D^® automatise entièrement l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel, ce qui simplifie l'analyse des protéines et produit des résultats plus reproductibles et cohérents, indépendamment de l'utilisateur. L'ingénierie efficace du système Auto2D^® réduit considérablement le temps de chargement des échantillons, de mise au point isoélectrique, d'équilibrage et de SDS-PAGE de 4-24 heures à seulement 1-2 heures. Le dispositif Auto2D^® est donc unique par rapport aux autres systèmes 2-DE semi-automatisés du marché.

Figure 1. Procédure d'électrophorèse bidimensionnelle sur gel et étapes automatisées par le dispositif Auto2D®.

Pourquoi utiliser l'électrophorèse 2D sur gel ?

Le dispositif d'électrophorèse 2D Auto2D^® a fait ses preuves dans de nombreuses applications. C'est le cas par exemple, pour analyser l'expression différentielle des protéines dans la recherche contre le cancer et l'élucidation des mécanismes pathologiques. Il facilite également la séparation des protéines purifiées pour la cristallisation ainsi que l'analyse des modifications post-translationnelles et le western blotting 2D dans la recherche sur les allergies ou l'analyse des voies de signalisation cellulaire.

Figure 2. Gauche : Analyse de l'expression différentielle des protéines au sein de cellules en culture pour la recherche sur les biomarqueurs du cancer. Le vert représente les protéines les plus abondantes dans les cellules normales. Le rouge représente les taches protéiques spécifiques du cancer. Le jaune représente la superposition dans l'expression des protéines. Droite : Expression différentielle des protéines dans des échantillons de plasma.

Figure 3. Gauche : Évaluation des microhétérogénéités dans des produits médicamenteux à base d'anticorps thérapeutiques. Le triangle rouge indique les taches de l'anticorps cible ; les taches inférieures sont les régions manquant d'anticorps. Droite : Analyse des protéines avant et après purification. La 2-DE permet de vérifier si l'échantillon est homogène pour la cristallisation et l'analyse structurelle par rayons X.

Figure 4. Protéines d'extrait de farine (détectées avec SYPRO Ruby) par SDS-PAGE (A), WB : Anticorps antigliadine par SDS-PAGE (B) et fusion par SDS-PAGE (C). Protéines d'extrait de farine (détectées avec SYPRO Ruby), les flèches indiquent les spots (taches) détectés par l'anticorps antigliadine (D). WB utilisant l'anticorps antigliadine (E) et fusion (F).

Mesure des HCP résiduelles dans les produits biopharmaceutiques

L'électrophorèse 2D sur gel sert également à analyser les protéines de cellules hôtes (HCP) contaminantes dans le bioprocessing des protéines et des anticorps thérapeutiques. Les impuretés HCP résiduelles introduites au cours des procédés de fabrication des produits biologiques peuvent déclencher des réponses immunogènes chez les patients et réduire l'efficacité des médicaments. La conformité réglementaire exige de surveiller et d'éliminer les HCP afin de revenir à des niveaux acceptables pour la sécurité. Les pharmacopées du Japon, de l'Europe et des États-Unis ont publié des directives pour le développement et la validation de dosages des HCP destinés à la fabrication de produits biopharmaceutiques.

Pour satisfaire les exigences de conformité, les dosages de HCP doivent être élaborés méthodiquement avec une qualification rigoureuse de tous leurs composants. Pour la validation des anticorps, deux électrophorèses bidimensionnelles sur gel de polyacrylamide (2D PAGE) sont nécessaires en vue d'obtenir une couverture complète des HCP. Les méthodes d'électrophorèse sur gel, y compris 2D-PAGE, sont également recommandées pour la caractérisation des antigènes servant d'étalons ou d'immunogènes pour la production d'anticorps polyclonaux. Grâce au dispositif d'électrophorèse 2D Auto2D^®, l'utilisateur n'a plus besoin d'une formation avancée, ce qui facilite la mise en œuvre dans les bioprocédés respectueux des normes de l'industrie.

Systèmes Auto2D^® destinés à valider les anticorps anti-HCP pour les dosages immuno-enzymatiques ELISA et autres

Les dosages ELISA sont les plus couramment employés pour l'analyse des HCP. Cette méthode de dosage immuno-enzymatique s'appuie sur des anticorps polyclonaux qui reconnaissent les HCP résiduelles avec une couverture étendue. Les pharmacopées japonaise et européenne spécifient l'utilisation de l'électrophorèse 2D sur gel suivie d'une analyse par western blotting (western blotting 2D) pour évaluer la couverture des anticorps anti-HCP. La pharmacopée des États-Unis spécifie l'utilisation du western blotting 2D ou de la purification par immunoaffinité suivie d'une électrophorèse sur gel pour évaluer la couverture des anticorps.

Figure 5. 20 μg d'antigène HCP de CHO marqué au Cy3 provenant d'une source du commerce ont été séparés par électrophorèse 2D sur gel avec le système Auto2D^® à l'aide d'une puce IEF de pH 3-10 et d'une puce PAGE à 12,5 % (A). Les protéines ont ensuite été transférées sur des membranes et analysées par western blotting à l'aide de deux anticorps anti-HCP différents (B, C). Les données indiquent que l'anticorps anti-HCP 1 possède une couverture des protéines de cellules hôtes plus large que l'anticorps anti-HCP 2.

Reproductibilité élevée du système Auto2D^®

Des procédés cohérents et reproductibles sont essentiels dans la fabrication et le contrôle qualité des produits biologiques. Outre des résultats plus rapides et un rendement plus élevé, le système d'électrophorèse sur gel entièrement automatisé Auto2D^® élimine les variations quotidiennes et interopérateurs dans les méthodes 2D-PAGE et 2D-DIGE, offrant une bien meilleure reproductibilité pour des résultats plus fiables.

Figure 6. 0,75 μg d'antigène HCP de CHO marqué au Cy5 provenant d'une source du commerce ont été séparés par électrophorèse 2D sur gel et analysés avec le système Auto2D^® à l'aide d'une puce IEF de pH 3-10NL et d'une puce PAGE à 12,5 %. Le même échantillon a été mesuré trois fois au total (A-C). Les spots blancs (D) montrent la superposition des résultats. Les données suggèrent une reproductibilité élevée de l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel avec le système Auto2D^®.

Système Auto2D^® pour le profilage des antigènes

Une immunisation avec l'antigène HCP est nécessaire afin d'obtenir des pools d'anticorps polyclonaux pour les dosages immuno-enzymatiques ELISA et autres. L'antigène HCP est également utilisé comme étalon pour la détection et la quantification. Des antigènes HCP spécifiques du procédé sont générés à l'aide de cultures de cellules négatives non transfectées. Ces antigènes doivent être caractérisés pour montrer le profil des HCP, confirmer la présence d'un large spectre de protéines et démontrer que les antigènes HCP issus des cultures négatives sont représentatifs de ceux des cultures de production. Les pharmacopées japonaise, européenne et américaine recommandent l'utilisation de l'électrophorèse 2D sur gel ou SDS-PAGE pour la caractérisation et le profilage des antigènes. La pharmacopée américaine suggère également que l'électrophorèse 2D sur gel serve de méthode complémentaire pour la surveillance des HCP résiduelles.

Figure 7. Un mélange d'antigène HCP de CHO non purifié marqué au Cy3 et d'antigène HCP de CHO purifié par la protéine A et marqué au Cy5 été séparé et analysé par électrophorèse sur gel différentielle bidimensionnelle (2D-DIGE) à l'aide du système Auto2D^® (A-B). Les taches rouges dans les données fusionnées (C) représentent les protéines de cellules hôtes qui ont tendance à rester même après la purification par la protéine A. Ces données montrent l'utilisation du système Auto2D^® pour le profilage des protéines de cellules hôtes résiduelles après la purification.

Système Auto2D^® pour la conformité réglementaire

Le système Auto2D^® aide à respecter les exigences réglementaires d'analyse des HCP lors de la fabrication de produits biopharmaceutiques. Ce système entièrement automatisé élimine les variations quotidiennes et interopérateurs pour obtenir des résultats fiables en moins de 2 heures. Facile à mettre en œuvre dans les workflows des bioprocédés, le système Auto2D^® réduit les périodes d'immobilisation du laboratoire dues aux changements de production. Pourquoi externaliser ? Protégez vos droits de propriété intellectuelle en confiant l'analyse des HCP à des ressources internes. Pour obtenir des produits et des ressources supplémentaires, consultez notre page Électrophorèse des protéines et western blotting.