Protocoles ELISA

Ces protocoles sont fournis à titre indicatif. Veuillez vous reporter au protocole détaillé du kit ELISA correspondant sur sa page de présentation. Vous pouvez explorer tous nos tests ELISA sur notre page dédiée aux tests ELISA.

• Test ELISA en sandwich
• Test de phosphorylation
• Dosage immunoenzymatique
• Test sur cellules

Test ELISA en sandwich

1. Amener tous les réactifs et les échantillons à température ambiante (18 °C à 25 °C) avant utilisation. Il est recommandé d'effectuer au moins deux répétitions de chaque étalon et de chaque échantillon.
2. Déposer 100 µl de chaque étalon et de chaque échantillon dans les puits appropriés. Couvrir et incuber pendant 2,5 heures à température ambiante ou pendant une nuit à 4 °C sous agitation modérée.
3. Jeter la solution et laver 4 fois avec la solution de lavage concentrée 1 ×. Laver les puits en les remplissant de tampon de lavage (300 µl), à l'aide d'une pipette multicanaux ou d'un laveur automatique. Pour de bons résultats, il est très important d'éliminer complètement le liquide à chaque étape du protocole. Après le dernier lavage, éliminer le tampon de lavage restant par aspiration ou transvasement. Sécher la plaque en la retournant sur du papier absorbant propre.
4. Déposer dans chaque puits 100 µl d'anticorps de détection préparé concentré 1 ×. Couvrir et incuber pendant 1 heure à température ambiante sous agitation modérée.
5. Jeter la solution. Répéter l'opération de lavage décrite à l'étape 3.
6. Déposer dans chaque puits 100 µl de solution de streptavidine préparée. Couvrir et incuber pendant 45 minutes à température ambiante sous agitation modérée.
7. Jeter la solution. Répéter l'opération de lavage décrite à l'étape 3.
8. Déposer dans chaque puits 100 µl de substrat TMB One-Step (composant H). Couvrir et incuber pendant 30 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière, sous agitation modérée.
9. Ajouter 50 µl de solution d'arrêt (composant I) dans chaque puits. Lire aussitôt l'absorbance à 450 nm.

Test de phosphorylation

1. Amener tous les réactifs à température ambiante (18 °C à 25 °C) avant utilisation. Il est recommandé d'effectuer au moins deux répétitions de chaque échantillon ou du témoin positif.
2. Déposer 100 µl de chaque échantillon ou du témoin positif dans les puits appropriés. Couvrir avec le support de plaque et incuber pendant 2,5 heures à température ambiante ou pendant une nuit à 4 °C sous agitation.
3. Jeter la solution et laver 4 fois avec la solution de lavage concentrée 1 ×. Laver les puits en les remplissant de tampon de lavage (300 µl), à l'aide d'une pipette multicanaux ou d'un laveur automatique. Pour de bons résultats, il est très important d'éliminer complètement le liquide à chaque étape du protocole. Après le dernier lavage, aspirer le tampon de lavage restant. Sécher la plaque en la retournant sur du papier absorbant propre.
4. Déposer dans chaque puits 100 µl d'anticorps anti-phosphotyrosine biotinylé concentré 1 ×. Incuber pendant 1 heure à température ambiante sous agitation.
5. Jeter la solution. Répéter l'opération de lavage décrite à l'étape 3.
6. Déposer dans chaque puits 100 µl de solution de streptavidine/peroxydase de raifort préparée concentrée 1 × (voir l'étape 6 du protocole de préparation du test). Incuber pendant 45 minutes à température ambiante sous agitation.
7. Jeter la solution. Répéter l'opération de lavage décrite à l'étape 3.
8. Déposer dans chaque puits 100 µl de substrat TMB One-Step (composant H). Incuber pendant 30 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière, sous agitation.
9. Ajouter 50 µl de solution d'arrêt (composant I) dans chaque puits. Lire aussitôt l'absorbance à 450 nm.

Dosage immunoenzymatique

1. Maintenir les réactifs du kit sur de la glace pendant la préparation du dosage. Il est recommandé d'effectuer au moins deux répétitions de chaque étalon et de chaque échantillon.
2. Déposer dans chaque puits 100 µl d'anticorps dirigés contre la cible. Incuber pendant 1,5 heure à température ambiante sous agitation modérée (1 à 2 cycles/seconde). Il est également possible d'incuber la plaque pendant une nuit à 4 °C.
3. Jeter la solution et laver les puits 4 fois avec le tampon de lavage concentré 1 × (200 à 300 µl par puits). Le lavage peut être effectué à l'aide d'une pipette multicanaux ou d'un laveur de microplaques automatisé. Pour de bons résultats, il est très important d'éliminer complètement le liquide à chaque étape du protocole. Après le dernier lavage, éliminer le tampon de lavage restant par aspiration ou transvasement. Sécher la plaque en la retournant sur du papier absorbant propre.
4. Déposer 100 µl de chaque étalon, du témoin positif ou de chaque échantillon dans les puits appropriés. Penser à laisser un puits vierge (diluant seul). Couvrir et incuber pendant 2,5 heures à température ambiante sous agitation modérée (1 à 2 cycles/seconde) ou pendant une nuit à 4 °C.
5. Jeter la solution et laver les puits 4 fois comme indiqué à l'étape 3.
6. Déposer dans chaque puits 100 μl de solution de streptavidine/peroxydase de raifort préparée. Incuber pendant 45 minutes à température ambiante sous agitation modérée. Il est recommandé de ne pas prolonger ni écourter les 45 minutes d'incubation.
7. Jeter la solution et laver les puits 4 fois comme indiqué à l'étape 3.
8. Déposer dans chaque puits 100 µl de substrat TMB One-Step (composant H). Incuber pendant 30 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière, sous agitation modérée (1 à 2 cycles/seconde).
9. Ajouter 50 µl de solution d'arrêt (composant I) dans chaque puits. Lire aussitôt l'absorbance à 450 nm.

Test sur cellules

REMARQUE : TOUTES les étapes d'incubation et de lavage doivent être réalisées sur un agitateur oscillant ou rotatif (1 à 2 cycles/seconde).

1. Concevoir le protocole expérimental.
   FACULTATIF : Pour l'inoculation de cellules HUVEC ou HMEC-1 ou d'autres cellules peu adhérentes, enduire la microplaque de 96 puits non revêtue (composant A) en déposant, dans chaque puits, 100 µl de poly-L-lysine (produit recommandé : P4832 de chez Sigma-Aldrich) et suivre les instructions d'utilisation. Le composant A peut être remplacé par une microplaque CellBIND^® pré-revêtue ou par toute autre plaque de culture tissulaire traitée à la polylysine.
2. Inoculer 100 µl de 10 000 à 30 000 cellules dans chaque puits de la microplaque de 96 puits non revêtue fournie (composant A) et incuber le tout pendant une nuit à 37 °C sous 5 % de CO₂.
   REMARQUE : Le nombre optimal de cellules à inoculer varie en fonction de la lignée cellulaire et du degré relatif de phosphorylation des protéines. Il est possible d'en utiliser plus ou moins, mais cela doit être déterminé empiriquement. REMARQUE : Les cellules peuvent être privées de nutriments pendant 4 à 24 heures (selon la lignée cellulaire) avant d'être traitées avec des inhibiteurs ou des activateurs.         
3. Appliquer différents traitements, inhibiteurs (pARNi ou produits chimiques) ou activateurs, conformément aux instructions d'utilisation, et incuber pendant les durées souhaitées. 
   REMARQUE : Avant de traiter les cellules, il est recommandé de dissoudre les inhibiteurs ou les activateurs dans un milieu de culture cellulaire sans sérum (sauf mention contraire dans les instructions d'utilisation).       
4. Jeter le milieu de culture cellulaire en retournant la plaque sur un évier et en tapotant sur l'arrière de la plaque.
5. La laver en pipettant 200 µl de tampon de lavage A préparé concentré 1 × (composant B) dans chaque puits. Jeter le tampon de lavage (comme décrit à l'étape 4) et laver la plaque 2 fois de plus, soit un total de 3 lavages, en utilisant à chaque fois du tampon de lavage frais. Après le dernier lavage, sécher délicatement la plaque en la retournant sur du papier absorbant afin d'éliminer tout surplus ou restant de tampon.
   REMARQUE : Pour éviter de perdre des cellules, ne pas pipetter directement le liquide sur ces dernières. Le déposer délicatement le long de la paroi des puits de culture cellulaire. Éviter également d'aspirer le contenu des puits ou de taper trop fort sur la plaque lors de l'élimination de la solution.       
6. Déposer dans chaque puits 100 µl de solution de fixation (composant D) et incuber pendant 20 minutes à température ambiante.
   REMARQUE : La solution de fixation sert à perméabiliser les cellules.  
7. Répéter l'opération de lavage décrite à l'étape 5.
8. Déposer dans chaque puits 200 µl de tampon de désactivation préparé concentré 1 × (composant E) et incuber 20 minutes à température ambiante.
   REMARQUE : Le tampon de désactivation sert à minimiser le bruit de fond.  
9. Laver les puits 4 fois avec le tampon de lavage A concentré 1 ×.
10. Déposer dans chaque puits 200 µl de tampon de blocage préparé concentré 1 × (composant F) et incuber pendant 1 heure à 37 °C. 
    
11. Laver les puits 3 fois avec le tampon de lavage B préparé concentré 1 × (composant C).
    REMARQUE : Après ce lavage, la plaque peut être conservée à -80 °C pendant plusieurs jours si nécessaire.
12. Déposer 50 µl de l'anticorps primaire préparé concentré 1 × (composant G-1, G-2, G-3, H-1, H-2 ou H-3) dans les puits appropriés et incuber pendant 2 heures à température ambiante.
13. Laver les puits 4 fois avec le tampon de lavage B concentré 1 ×.
14. Déposer dans chaque puits 50 µl de l'anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort préparé concentré 1 × (composant I-2) et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
15. Répéter l'étape 13.
16. Déposer dans chaque puits 100 µl de substrat TMB (composant J) et incuber pendant 30 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière.
17. Ajouter 50 μl de solution d'arrêt (composant K) dans chaque puits. Lire aussitôt l'absorbance à 450 nm.