Preparación manual de los geles para PAGE y SDS-PAGE utilizando los kits de moldeo de gel Bis-Tris TurboMix mPAGE^®

• Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)
• Química del gel de poliacrilamida
• Preparación manual de los geles de poliacrilamida
• Kit de preparación del gel bis-Tris TurboMix mPAGE ^®
• Vídeo de demostración
• Protocolo de preparación rápida TurboMix mPAGE^®
• Preparación de las muestras y corrida del gel
• Información para pedidos

Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)

La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) es una técnica fundamental utilizada para separar proteínas y otras macromoléculas por su movilidad electroforética. Los geles de poliacrilamida se forman mediante la polimerización de monómeros de acrilamida y moléculas reticulantes de bis-acrilamida. Juntas, la acrilamida y la bis-acrilamida forman poros a través de los cuales pueden migrar las proteínas.

Los geles de poliacrilamida se componen de dos partes: una porción de carga o concentradora y una porción separadora o de resolución. La porción concentradora del gel consta de un bajo porcentaje de acrilamida y sirve para concentrar las muestras en una sola banda antes de que entren en el gel separador. El gel separador consta de un porcentaje mayor de acrilamida que separa las proteínas por tamaño. La concentración de acrilamida está relacionada linealmente con el tamaño de los poros; una mayor concentración de acrilamida dará lugar a poros más pequeños dentro del gel. Los poros pequeños son deseables para separar proteínas de bajo peso molecular.

Química del gel de poliacrilamida

En la PAGE se utiliza un sistema amortiguador discontinuo, en el que el ion tampón del gel difiere del ion tampón de corrida. La diferencia en la movilidad electroforética entre estos dos iones forma un gradiente de voltaje en movimiento a través del cual se desplazan las proteínas. El gel de Tris-glicina es el sistema de PAGE más utilizado y consta de geles compuestos por Tris-HCl y tampón de electroforesis compuesto por Tris base y glicina. Los geles de Tris-glicina actúan en un entorno muy alcalino que puede inducir modificaciones indeseables en las proteínas como desaminación y alquilación. Como consecuencia, las bandas de proteínas pueden estar distorsionadas o perder resolución en los geles de Tris-glicina.

Por el contrario, en los geles de bis-Tris se utiliza bis-Tris y HCl en el tampón del gel y MOPS o MES en el tampón de electroforesis. Los geles bis-Tris actúan a un pH neutro, lo que minimiza la modificación de las proteínas y promueve su estabilidad durante el desplazamiento del gel. Esto lleva a una resolución y precisión más nítidas de las bandas de proteína. Los geles de bis-Tris tienen también una vida útil más larga que los geles de Tris-glicina, que empiezan a hidrolizarse con el tiempo. Los geles de bis-Tris tienen la flexibilidad de poder combinarse con disoluciones tampón de electroforesis compuestas por MOPS o MES; la diferencia en la migración entre estos dos iones tiene como consecuencia diferentes intervalos de separación de las proteínas. El MES debe utilizarse cuando la proteína de interés es pequeña (<50 kDa), mientras que el MOPS debe utilizarse para separar proteínas de tamaño medio a grande.

También es importante tener en cuenta el tipo de tampón de muestra utilizado durante la preparación de las proteínas. En los geles de Tris-glicina, suele utilizarse el tampón Laemmli para desnaturalizar y recubrir las proteínas en los iones de SDS con carga negativa. A continuación, se hierven las muestras a 100 °C para facilitar la desnaturalización. Calentar el tampón Laemmli a 100 °C hace que el pH se vuelva muy ácido, y se ha demostrado que esta combinación de calor y acidez causa la escisión de las proteínas preferentemente en los enlaces peptídicos Asp-Pro (Rittenhouse y Marcus, 1984). Esto induce productos aparentes de degradación de las proteínas durante la electroforesis. Por el contrario, en los geles de bis-Tris se utiliza un tampón de muestras de LDS que mantiene un pH alcalino durante la preparación de la muestra y no requiere calentamiento por encima de 70 °C para desnaturalizar por completo las proteínas. Esta preparación mantiene la integridad de las proteínas al reducir al mínimo la escisión del enlace peptídico Asp-Pro.

Tabla 1. Comparación de las propiedades químicas de los geles de Tris-glicina y de bis-Tris

	Tris-glicina	bis-Tris
pH operativo	9,5 (alcalino)	7,0 (neutro)
pH del tampón de la muestra	5,2	8,5
Frentes iónicos	Tris (+) Glicina (-)	Tris (+) MOPS (-) MES (-)
Intervalo de separación de las proteínas	6 kDa – 400 kDa	6 kDa – 400 kDa
Estabilidad de las proteínas durante la separación	Puede producirse desaminación y alquilación	+++
Efecto sobre los enlaces peptídicos Asp-Pro	El calentamiento prolongado en el tampón de muestras SDS provoca escisión	Con el tampón de muestras LDS se utilizan condiciones de calentamiento suaves y los enlaces Asp-Pro permanecen intactos
Tiempo de procesamiento	Moderado	Rápido
Periodo de validez	Limitada	+ de 4 semanas

Figura 1. Comparación de los geles de Tris-glicina (izquierda) y bis-Tris (derecha). Se prepararon los geles de Tris-glicina y bis-Tris a mano con acrilamida al 12 % y se dejó que polimerizaran durante la noche. Los geles se cargaron con valoraciones idénticas de lisado de E. coli (carriles 3-6), patrón proteico sin teñir mPAGE^® (carriles 2 y 7) y patrón proteico teñido mPAGE^® (carril 1). Los geles se procesaron en tampón de electroforesis Tris-glicina o MOPS, se tiñeron con la tinción de gel de proteínas ReadyBlue™ durante una hora y se destiñeron con agua desionizada durante una hora.

Preparación manual de los geles de poliacrilamida

Si bien pueden adquirirse geles de poliacrilamida prefabricados para fines especializados, como el análisis de proteínas de diferentes tamaños en un gradiente de acrilamida, muchos investigadores optan por preparar sus propios geles de poliacrilamida a mano. Los geles de poliacrilamida moldeados a mano son baratos en comparación con los geles prefabricados; sin embargo, la preparación de los reactivos y los equipos de montaje puede ser larga y tediosa. Variaciones en la preparación del tampón del gel pueden inducir también inconsistencia en el rendimiento y la calidad del gel.

Kit de preparación del gel bis-Tris TurboMix mPAGE^®

El kit de moldeo del gel bis-Tris Turbomix mPAGE^® elimina la variabilidad y la lentitud que implica el moldeo a mano de los geles al suministrar disoluciones tampón y de acrilamida premezcladas. El kit consta de una disolución separadora de acrilamida al 20 % (Resolving Solution) para formar la porción separadora de un gel de acrilamida. La disolución separadora puede diluirse con agua desionizada hasta el porcentaje deseado de acrilamida, del 8 % al 15 %. El kit también incluye una disolución de carga o concentradora de acrilamida al 4 % (Stacking Solution) para constituir la porción concentradora de un gel de acrilamida. Estas disoluciones están formuladas para permitir un método de preparación rápida sin tiempo de espera para la polimerización entre el vertido de los geles separador y concentrador. A continuación encontrará un vídeo de /ES/esdemostración y un breve protocolo.

Vídeo de /ES/esdemostración: Moldee sus propios geles de poliacrilamida utilizando los kits bis-Tris TurboMixmPAGE^®

PROTOCOLO DE PREPARACIÓN RÁPIDA TurboMix mPAGE^®

1. Prepare el gel separador con el porcentaje de acrilamida deseado pipeteando la disolución separadora (Resolving) TurboMix mPAGE^®, agua desionizada, persulfato de amonio (APS) al 10 % y TEMED en un vaso de precipitado o un tubo cónico de vidrio limpios. Los volúmenes de las Tablas 2-4 pueden multiplicarse para preparar varios geles a la vez. NOTA: Agregue el APS al 10 % y el TEMED inmediatamente antes de la preparación.

Tabla 2. Preparación de las disoluciones separadora y concentradora para la formación del gel Los volúmenes indicados son suficientes para montar un minigel de 7,4 x 8,2 cm con un grosor de 1 mm y se pueden multiplicar por n (número deseado de geles) para montar varios geles a la vez.

(Para un minigel de 1 mm de grosor)
Gel separador		Gel concentrador
Porcentaje de gel	8%	10%	12%	15%	4%
Disolución separadora TurboMix mPAGE®	2,4 ml	3,0 ml	3,6 ml	4,5 ml	n/a
Disolución de carga TurboMix mPAGE®	n/a	n/a	n/a	n/a	2 ml
Agua desionizada	3,6 ml	3,0 ml	2,4 ml	1,5 ml	n/a
APS al 10 %	30 µl	30 µl	30 µl	30 µl	20 µl
TEMED	3 µl	3 µl	3 µl	3 µl	2 µl

Tabla 3. Preparación de las disoluciones separadora y concentradora para la formación del gel Los volúmenes indicados son suficientes para montar un minigel de 7,4 x 8,2 cm con un grosor de 0,75 mm y se pueden multiplicar por n (número deseado de geles) para montar varios geles a la vez.

(Para un minigel de 0,75 mm de grosor)
Gel separador		Gel concentrador
Porcentaje de gel	8%	10%	12%	15%	4%
Disolución separadora TurboMix mPAGE®	1,8 ml	2,25 ml	2,7 ml	3,38 ml	n/a
Disolución de carga TurboMix mPAGE®	n/a	n/a	n/a	n/a	1,5 ml
Agua desionizada	2,7 ml	2,25 ml	1,8 ml	1,12 ml	n/a
APS al 10%	22,5 µl	22,5 µl	22,5 µl	22,5 µl	15 µl
TEMED	2,25 µl	2,25 µl	2,25 µl	2,25 µl	1,5 µl

Tabla 4. Preparación de las disoluciones separadora y concentradora para la formación del gel Los volúmenes indicados son suficientes para montar un minigel de 7,4 x 8,2 cm con un grosor de 1,5 mm y se pueden multiplicar por n (número deseado de geles) para montar varios geles a la vez.

(Para un minigel de 1,5 mm de grosor)
Gel separador		Gel concentrador
Porcentaje de gel	8%	10%	12%	15%	4%
Disolución separadora TurboMix mPAGE®	3,6 ml	4,5 ml	5,4 ml	6,75 ml	n/a
Disolución de carga o concentradora TurboMix mPAGE®	n/a	n/a	n/a	n/a	3,0 ml
Agua desionizada	5,4 ml	4,5 ml	3,6 ml	2,25 ml	n/a
APS al 10%	45 µl	45 µl	45 µl	45 µl	30 µl
TEMED	4,5 µl	4,5 µl	4,5 µl	4,5 µl	2 µl

2. Prepare el gel concentrador pipeteando la disolución concentradora (Solution Stacking) TurboMix mPAGE^® en un vaso de precipitado o un tubo cónico de vidrio limpio distinto y añada la cantidad necesaria de TEMED y APS al 10 %. NOTA: Agregue el APS al 10 % y el TEMED inmediatamente antes de la preparación.
3. Mezcle suavemente los reactivos, evitando la introducción de burbujas de aire en la mezcla de gel.
4. Con una pipeta serológica, llene cada casete con gel separador hasta la altura deseada.
5. Coloque la pipeta serológica en el centro de la casete y añada suavemente el gel concentrador, llenando hasta el tope de la placa corta. Puede que se hunda algo donde realice el pipeteo, pero se nivelará.
6. Introduzca con cuidado y rapidez el peine, evitando que queden burbujas de aire debajo de los dientes.
7. Deje polimerizar los geles durante 1 hora.
8. Los geles pueden utilizarse inmediatamente o envolverse en toallitas de papel empapadas en agua desionizada y almacenarse en un recipiente hermético a 4 °C durante un máximo de 4 semanas.

Preparación de las muestras y corrida del gel

1. Los geles bis-Tris requieren un tampón de carga de muestras LDS, que es más alcalino que el tampón de muestras SDS. Las muestras pueden reducirse utilizando DTT o β-mercaptoetanol, o pueden utilizarse sin reducir, dependiendo de la aplicación. Prepare las muestras de acuerdo con la Tabla 5.
   

Tabla 5. Ejemplo de preparación de muestras para PAGE. La concentración final del tampón de muestra LDS debe ser de 1X. La concentración final del TDT debe ser de 0,1 M.

	Reducida	No reducida
Muestra	6,5 - X µl	7,5 - X µl
Agua DI	X µl	X µl
Tampón LDS 4X tampón 4X	2,5 µl	2,5 µl
TDT 1 M	1 µl	N/A
Volumen total	10 µl	10 µl

2. Caliente las muestras durante 10 minutos a 70 °C (sin que hierva).
3. Cargue las muestras y el patrón de proteínas en los pocillos.
4. Añada una cantidad igual de tampón de carga 1X a los pocillos vacíos.
5. Los geles pueden hacerse correr a 200 V hasta que el colorante o el patrón de proteínas llegue al final del gel, aproximadamente 30-60 minutos, dependiendo del porcentaje de gel.