Pasos y método de secuenciación de Sanger

¿Qué es la secuenciación de Sanger?

La secuenciación de Sanger, también conocida como el “método de terminación de la cadena”, es un método para determinar la secuencia de nucleótidos del ADN. El método fue desarrollado por el dos veces Premio Nobel Frederick Sanger y sus colegas en 1977, de ahí el nombre de la Secuencia de Sanger.

Para revisar la estructura general del ADN, vea la Figura 2.

¿Cómo funciona la secuenciación de Sanger?

La secuenciación de Sanger se puede realizar manualmente o, lo más habitual, de forma automatizada a través de una máquina de secuenciación (Figura 1). Cada método sigue tres pasos básicos, como se describe a continuación.

Figura 1. Tres pasos básicos de la secuenciación automatizada de Sanger.

Pasos de la secuenciación de Sanger

La secuenciación de Sanger consta de tres pasos principales.

1. Secuencia del ADN para PCR de terminación de la cadena

La secuencia de ADN de interés se utiliza como plantilla para un tipo especial dePCR denominado PCR de terminación de la cadena. La PCR de terminación de la cadena funciona igual que la PCR convencional, pero con una importante diferencia: la adición de nucleótidos modificados (dNTP) denominados didesoxirribonucleótidos (ddNTP). En el paso de extensión de la PCR convencional, la ADN polimerasa añade los dNTP a una cadena de ADN en crecimiento catalizando la formación de un enlace fosfodiéster entre el grupo 3’-OH libre del último nucleótido y el 5’-fosfato del siguiente (Figura 2).

En la PCR de terminación de la cadena, el usuario mezcla una proporción baja de ddNTP de terminación de la cadena con los dNTP normales en la reacción de PCR. Los ddNTP carecen del grupo 3'-OH requerido para la formación de enlaces fosfodiéster; por lo que, cuando la ADN polimerasa incorpora un ddNTP al azar, la extensión cesa. El resultado de la PCR de terminación de la cadena es el de millones a miles de millones de copias de oligonucleótidos de la secuencia de ADN de interés, terminada en longitudes aleatorias (n) por 5’-ddNTP.

En la secuenciación de Sanger manual, se configuran cuatro reacciones de PCR, cada una con un único tipo de ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP y ddCTP) mezclado.

En la secuenciación de Sanger automatizada, todos los ddNTP se mezclan en una sola reacción, y cada uno de los cuatro dNTP tiene una etiqueta fluorescente única.

2. Separación por tamaño en electroforesis en gel

En el segundo paso, los oligonucleótidos de cadena terminada se separan por tamaño mediante electroforesis en gel. En la electroforesis en gel, las muestras de ADN se cargan en un extremo de una matriz de gel, y se aplica una corriente eléctrica; el ADN tiene carga negativa, por lo que los oligonucleótidos serán atraídos hacia el electrodo positivo en el lado opuesto del gel. Debido a que todos los fragmentos de ADN tienen la misma carga por unidad de masa, la velocidad a la que se mueven los oligonucleótidos vendrá determinada únicamente por su tamaño. Cuanto más pequeño sea un fragmento, menos fricción experimentará a medida que se desplaza por el gel, y más rápido se moverá. Como consecuencia, los oligonucleótidos se ordenarán de más pequeño a más grande, si se lee el gel de abajo a arriba.

En la secuenciación de Sanger manual, los oligonucleótidos de cada una de las cuatro reacciones de PCR se hacen correr en cuatro carriles separados de un gel. Esto permite al usuario saber qué oligonucleótidos corresponden a cada ddNTP.

En la secuenciación de Sanger automatizada, todos los oligonucleótidos se ejecutan en una sola electroforesis capilar en gel dentro de la máquina de secuenciación.

3. Análisis del gel y determinación de la secuencia del ADN

El último paso consiste simplemente en leer el gel para determinar la secuencia del ADN de entrada. Dado que la ADN polimerasa solo sintetiza ADN en la dirección 5’ a 3’ comenzando en un cebador proporcionado, cada ddNTP terminal corresponderá a un nucleótido específico en la secuencia original (por ejemplo, el fragmento más corto debe terminar en el primer nucleótido desde el extremo 5’, el segundo fragmento más corto debe terminar en el segundo nucleótido desde el extremo 5', etc.) Por consiguiente, al leer las bandas de gel de más pequeño a más grande, podemos determinar la secuencia 5’ a 3’ de la cadena del ADN original.

En la secuenciación de Sanger manual, el usuario lee los cuatro carriles del gel a la vez yendo de abajo hacia arriba, utilizando el carril para determinar la identidad del ddNTP terminal para cada banda. Por ejemplo, si la banda inferior se encuentra en la columna que corresponde al ddGTP, entonces el fragmento de PCR más pequeño termina en ddGTP, y el primer nucleótido del extremo 5' de la secuencia original tiene una base guanina (G).

En la secuenciación de Sanger automatizada, un ordenador lee cada banda del gel capilar en orden y utiliza la fluorescencia para determinar la identidad de cada ddNTP terminal. En resumen, un láser excita las etiquetas fluorescentes en cada banda, y una computadora detecta la luz emitida resultante. Debido a que cada uno de los cuatro ddNTP está etiquetado con una etiqueta fluorescente diferente, la luz emitida se puede vincular directamente a la identidad del ddNTP terminal. Lo que se obtiene es un cromatograma, que muestra el pico fluorescente de cada nucleótido a lo largo de la longitud de la plantilla de ADN.

Figura 2. Esquema de la estructura del ADN. El ADN es una molécula compuesta por dos hebras que se enrollan una alrededor de la otra para formar una doble hélice. Cada hebra está formada por una cadena de moléculas llamadas desoxirribonucleótidos (dNTP).

Cada dNTP contiene un grupo fosfato, un azúcar y una de las cuatro bases nitrogenadas [adenina (A), timina (T), guanina (G) o citosina (C)]. Los dNTP se enlazan de manera lineal mediante enlaces covalentes fosfodiéster entre el azúcar de un dNTP y el grupo fosfato del siguiente; este patrón repetido azúcar-fosfato constituye el esqueleto azúcar-fosfato.

Las bases nitrogenadas de las dos hebras independientes están unidas por enlaces de hidrógeno entre bases complementarias para formar la hélice de ADN de doble cadena.

Cómo leer los resultados de la secuenciación de Sanger

La lectura correcta de los resultados de la secuenciación de Sanger dependerá de cuál de las dos hebras de ADN complementarias es la de interés y de cuál es el cebador del que se dispone. Si las dos hebras de ADN son A y B, y la cadena de interés es la hebra A, pero el cebador es mejor para la cadena B, los fragmentos de salida serán idénticos a la cadena A. Por otro lado, si la cadena A es la de interés y el cebador es mejor para la cadena A, el producto de salida será idéntico a la cadena B. Por consiguiente, deberá ser convertida a la cadena A.

Así pues, si la secuencia de interés se lee “TACG” y el cebador es mejor para esa cadena, el producto de salida será “ATGC” y, por lo tanto, debe ser convertido de nuevo a “TACG”. Sin embargo, si el cebador es mejor para la hebra complementaria (“ATGC”), el producto de salida será “TACG”, que es la secuencia correcta.

En resumen, antes de empezar, hay que saber cuál es la diana y cómo llegar hasta ahí. Teniendo esto en cuenta, a continuación exponemos explicamos el ejemplo anterior (TACG -> ATGC -> TACG). Si las etiquetas de los didesoxinucleótidos son T = amarillo, A = rosa, C = azul oscuro y G = azul claro, dispondremos al final de las secuencias cortas cebador-A, cebador-AT, cebador-ATG y cebador-ATGC. Una vez separados los fragmentos mediante electroforesis, el láser leerá los fragmentos en orden de longitud (rosa, amarillo, azul claro y azul oscuro) y producirá un cromatograma. El ordenador convertirá las letras, de modo que la secuencia final será el TACG correcto.

Secuenciación de Sanger frente a PCR

En la secuenciación de Sanger y en la PCR se utilizan materiales de partida similares y pueden utilizarse juntas, pero ninguna puede sustituir a la otra.

La PCR se utiliza para amplificar el ADN en su totalidad. Si bien pueden producirse fragmentos de diferentes longitudes por casualidad (por ejemplo, la ADN polimerasa puede desprenderse), el objetivo es duplicar la secuencia de ADN entera. Para ello, los “ingredientes” son el ADN diana, los nucleótidos, el cebador de ADN y la ADN polimerasa (específicamente la polimerasa Taq, que puede sobrevivir a las altas temperaturas requeridas en la PCR).

Por el contrario, el objetivo de la secuenciación de Sanger es generar todas las posibles longitudes del ADN hasta la longitud completa del ADN diana. Por este motivo, se necesitan los didesoxinucleótidos además de los materiales de partida de la PCR.

La secuenciación de Sanger y la PCR se pueden combinar generando el material de partida para un protocolo de secuenciación de Sanger. La PCR se puede utilizar para crear muchas copias del ADN que se quiere secuenciar.

Tener más de una plantilla para trabajar hace que el protocolo de Sanger sea más eficiente. Si la secuencia de destino es de 1 000 nucleótidos de longitud y solo hay una copia de la plantilla, se tardará más en generar los 1 000 fragmentos etiquetados. Sin embargo, si hay varias copias de la plantilla, en teoría se tardará menos en generar los 1 000 fragmentos etiquetados.