Dispositivo de electroforesis bidimensional en gel automatizada Auto2D^®

¿Cómo funciona la electroforesis bidimensional en gel? Las técnicas de electroforesis de proteínas unidimensional en gel como la SDS-PAGE se realizan de forma habitual en el laboratorio y ofrecen poca capacidad de separación. La electroforesis bidimensional en gel (2-DE) separa las proteínas de muestras complejas por valor de pI y peso molecular, lo que permite la comparación directa simultánea de cientos o miles de proteínas con alta resolución. Cuando se combina con software analítico, inmunodetección o técnicas de espectrometría de masas, la 2-DE proporciona una herramienta potente que ayuda a la identificación de proteínas y otros análisis proteómicos. Si desea obtener más recursos y productos, visite nuestra página de electroforesis de proteínas e inmunoelectrotransferencia.

• Electroforesis bidimensional en gel totalmente automatizada
• ¿Cómo se hace correr un gel 2-D utilizando el dispositivo de electroforesis Auto2D^® 2-D?
• ¿Por qué utilizamos electroforesis bidimensional en gel?
• Medición de las HCP residuales en los productos biofarmacéuticos
• Sistemas Auto2D^® para la validación de anticuerpos anti-HCP para ELISA y otros inmunoanálisis
• Alta reproducibilidad del sistema Auto2D^®
• Sistema Auto2D^® para perfilado de antígenos
• Sistema Auto2D^® para el cumplimiento normativo

 

Electroforesis bidimensional en gel totalmente automatizada

En general, se ha considerado que la electroforesis bidimensional en gel es tan difícil de realizar y requiere tanto tiempo, que exige una formación avanzada del usuario, al tiempo que ofrece una baja reproducibilidad y una gran variabilidad de unos técnicos a otros. El sistema Auto2D^® automatiza por completo la electroforesis en gel bidimensional. La muestra aplicada entra pasivamente en el gel de la primera dimensión, separando las proteínas por sus puntos isoeléctricos. Después del equilibrio, el gel de primera dimensión se coloca en un gel SDS-PAGE horizontal, que resuelve las proteínas por peso molecular. El dispositivo de electroforesis 2-D Auto2D^® es fácil de usar y permite la electroforesis bidimensional en 1-2 horas para obtener resultados más rápidos y reproducibles. Otras características y ventajas del dispositivo de electroforesis Auto2D^® son:

• Fácil de usar, sin necesidad de formación avanzada
• Ejecución rápida de la secuencia de trabajo para reducir el tiempo de inactividad del laboratorio
• Menor variabilidad entre los técnicos y mayor reproducibilidad
• Soporte IQ/OQ para el cumplimiento de las GMP

¿Cómo se hace correr un gel 2-D utilizando el dispositivo de electroforesis Auto2D^®?

El dispositivo de electroforesis 2-D Auto2D^® automatiza completamente la electroforesis en gel bidimensional, lo que simplifica el análisis de proteínas y proporciona resultados más uniformes y reproducibles, independientes del usuario. La ingeniería eficiente del sistema Auto2D^® reduce significativamente el tiempo empleado durante la carga de las muestras, el enfoque isoeléctrico, el equilibrado y la SDS-PAGE de 4-24 horas a solo 1-2 horas. Esto hace que la unidad Auto2D^® sea única en comparación con otros sistemas 2-DE semiautomáticos del mercado.

Figura 1. Procedimiento de trabajo de la electroforesis en gel bidimensional y los pasos que están automatizados en el dispositivo Auto2D®.

¿Por qué utilizamos electroforesis bidimensional en gel?

El dispositivo de electroforesis 2-D Auto2D^® ha sido probado en numerosas aplicaciones. Ejemplos de casos de uso adecuado son el análisis de la expresión diferencial de proteínas en la investigación del cáncer y la dilucidación de los mecanismos de la enfermedad. Otras aplicaciones son su utilización para la separación de proteínas purificadas para cristalización o análisis de la modificación postraduccional y la inmunoelectrotransferencia bidimensional en áreas experimentales como la investigación de alergias o el análisis de vías de comunicación celular.

Figura 2. Izquierda: Análisis de expresión diferencial de proteínas en células cultivadas para la investigación de biomarcadores oncológicos. El verde representa las proteínas más abundantes en las células normales. El rojo representa las manchas de proteínas específicas del cáncer. El amarillo representa el solapamiento en la expresión proteica. Derecha: Expresión diferencial de proteínas en muestras de plasma.

Figura 3. Izquierda: Evaluación de microheterogeneidades en inmunoconjugados terapéuticos. El triángulo rojo indica manchas correspondientes al anticuerpo específico; las manchas inferiores son regiones donde faltan anticuerpos. Derecha: Análisis de proteínas antes y después de la purificación. La 2-DE puede utilizarse para comprobar si la muestra es homogénea para la cristalización y el análisis estructural mediante rayos X.

Figura 4. Proteínas de extracto de harina (detectadas por SYPRO Ruby) por SDS-PAGE (A), WB: anticuerpo antigliadina mediante SDS-PAGE (B) y fusión mediante SDS-PAGE (C). Proteínas de extracto de harina (detectadas por SYPRO Ruby); las flechas indican manchas detectadas por el anticuerpo antigliadina (D). WB con anticuerpo antigliadina (E) y fusión (F).

Medición de las HCP residuales en los productos biofarmacéuticos

La electroforesis bidimensional en gel también es adecuada para el análisis de las proteínas de la célula huésped (HCP) contaminantes en el bioprocesamiento terapéutico de proteínas y anticuerpos. Las impurezas HCP residuales introducidas durante los procesos de fabricación de biofármacos pueden desencadenar respuestas inmunogénicas en los pacientes y reducir la eficacia del fármaco. El cumplimiento normativo exige la supervisión y la eliminación de las HCP hasta niveles aceptablemente bajos para garantizar la seguridad. Las farmacopeas de Japón, Europa y Estados Unidos han publicado directrices para el desarrollo y la validación de análisis de las HCP durante la fabricación de productos biofarmacéuticos.

Para cumplir con la normativa, los análisis de las HCP deben desarrollarse metódicamente con una cualificación rigurosa de todos los componentes del análisis. Para la validación de anticuerpos, se requiere electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional (2D PAGE) para garantizar una cobertura integral de las HCP. También se recomiendan métodos de electroforesis en gel, como la 2D PAGE, para la caracterización de los antígenos utilizados como patrones de calibración o los inmunógenos para la producción de anticuerpos policlonales. La unidad de electroforesis 2-D Auto2D^® elimina la necesidad de formación avanzada del usuario, lo que facilita su implantación en los procedimientos de trabajo de bioprocesos para cumplir con los estándares del sector.

Sistemas Auto2D^® para la validación de anticuerpos anti-HCP para ELISA y otros inmunoanálisis

Los ELISA son el formato analítico más común para el análisis de HCP. Este método de inmunoanálisis se basa en anticuerpos policlonales que reconocen los HCP residuales con una amplia cobertura. La farmacopea japonesa y europea especifica el uso de la electroforesis bidimensional en gel seguida del análisis mediante inmunoelectrotransferencia (Western blotting 2-D) para evaluar la cobertura de anticuerpos anti-HCP. La farmacopea de los EE. UU. especifica el uso de Western blotting 2-D o purificación por inmunoafinidad seguida de electroforesis en gel para evaluar la cobertura de anticuerpos.

Figura 5. Se separaron 20 μg de antígeno HCP de CHO marcado con Cy3 de una fuente comercial mediante electroforesis en gel 2-D en el sistema Auto2D^® utilizando un chip IEF de pH 3-10 y un chip PAGE al 12,5 % (A). Las proteínas se transfirieron luego a las membranas y se analizaron mediante inmunoelectrotransferencia usando dos anticuerpos anti-HCP diferentes (B, C). Los datos indican que el anticuerpo anti-HCP 1 tiene una cobertura más amplia de las proteínas de las células huésped que el anticuerpo anti-HCP 2.

Gran reproducibilidad del sistema Auto2D^®

En la fabricación de biofármacos y el control de calidad es esencial que los procesos sean uniformes y reproducibles. Además de resultados más rápidos y un mayor rendimiento, el sistema de electroforesis en gel Auto2D^® totalmente automatizado elimina la variabilidad diaria y entre los analistas en los métodos de 2D PAGE y 2D DIGE, lo que ofrece una reproducibilidad significativamente mejor para obtener resultados más fiables.

Figura 6. Se separaron 0,75 μg de antígeno HCP de CHO marcado con Cy5 de una fuente comercial mediante electroforesis 2D en gel y se analizó en el sistema Auto2D^® utilizando un chip IEF de pH 3-10 y un chip PAGE al 12,5 %. La misma muestra se midió un total de tres veces (A-C). Las manchas blancas (D) indican solapamiento de los resultados. Los datos sugieren una gran reproducibilidad de la electroforesis bidimensional en gel con el sistema Auto2D^®.

Sistema Auto2D^® para perfilado de antígenos

Se requiere la inmunización con antígenos HCP para obtener grupos de anticuerpos policlonales para ELISA y otros inmunoanálisis. El antígeno HCP se utiliza también como patrón de calibración para detección y cuantificación. Los antígenos HCP específicos del proceso se generan mediante cultivos de células nulas no transfectadas. Estos antígenos deben caracterizarse para mostrar el patrón de los HCP, confirmar la presencia de un amplio espectro de proteínas y demostrar que los antígenos HCP procedentes de cultivos nulos son representativos de los procedentes de cultivos de producción. Las farmacopeas japonesa, europea y estadounidense recomiendan el uso de electroforesis en gel SDS-PAGE o 2-D para la caracterización y el perfilado de antígenos. La Farmacopea de los Estados Unidos sugiere también el uso de la electroforesis en gel 2-D como método complementario para la supervisión de las HCP residuales.

Figura 7. Se separó una mezcla de antígenos HCP de CHO no purificados marcados con Cy3 y antígenos HCP de CHO purificados en proteína A marcados con Cy5 y se analizó mediante electroforesis en gel diferencial bidimensional (2D-DIGE) utilizando el sistema Auto2D^® (A-B). Las machas rojas en los datos fusionados (C) representan proteínas de la célula huésped que tienden a permanecer incluso después de la purificación con proteína A. Estos datos demuestran el uso del sistema Auto2D^® para perfilar los componentes proteicos remanentes de la célula huésped después de la purificación.

Sistema Auto2D^® para cumplimiento normativo

El sistema Auto2D^® le ayuda a cumplir con los requisitos normativos para el análisis de HCP en la fabricación biofarmacéutica. Este sistema totalmente automatizado elimina la variabilidad diaria y entre analistas para obtener resultados fiables en menos de 2 horas. Fácil de implantar en los procedimientos de trabajo de bioprocesos, el sistema Auto2D^® reduce el tiempo de inactividad del laboratorio asociado a los cambios de producción. No hay necesidad de externalizar: proteja su propiedad intelectual utilizando recursos internos para el análisis de las HCP. Si desea obtener más recursos y productos, visite nuestra página de electroforesis de proteínas e inmunoelectrotransferencia.