Efecto del método de purificación GenElute™-E en la precisión de la cuantificación del ADN y en los procesos enzimáticos posteriores
Estos métodos de adsorción-lavado-elución son tediosos y requieren varios pasos de lavado y centrifugado. Los pasos de centrifugado repetidos pueden dar lugar a una fragmentación significativa del ADN. Además, pueden arrastrarse las sales caotrópicas y otros contaminantes en el ADN o el ARN eluido, lo que afecta a la pureza final y a la cuantificación, así como a los procesos enzimáticos posteriores, como la PCR.
Evaluamos un nuevo sistema de purificación de ácidos nucleicos de un solo centrifugado que elimina la necesidad de los pasos de gran adsorción salina y de lavado con etanol. En los kits de purificación de ADN y ARN GenElute™-E se emplea un método de cromatografía negativa dependiente de la exclusión por tamaño para separar las moléculas grandes, correspondientes a los ácidos nucleicos ADN y ARN, de las proteínas, los lípidos y los componentes iónicos más pequeños en las muestras celulares, tisulares, sanguíneas y de otro tipo (Figuras 1-2).
Figura 1.Purificación de ácidos nucleicos utilizando técnicas de cromatografía negativa (exclusión por tamaño).
Figura 2.Elución de ADN purificado y retención de proteínas, lípidos y otras moléculas utilizando el kit GenElute™-E de gran producción de ADN sanguíneo mediante un solo centrifugado con muestras sanguíneas de ratón. A) Espectros de absorbancia del ADN genómico purificado (línea roja). B) Espectros de absorbancia del retenido de la columna de centrifugación GenElute™-E (línea negra) superpuestos a los espectros de ADN purificado (rojo). Los espectros del retenido muestran proteínas y otros contaminantes con OD a ~280 nm o ≤240 nm. Obsérvese el cambio de escala en el eje de ordenadas (y).
Evaluamos el efecto del método de purificación de ácidos nucleicos en las impurezas que interfieren en la cuantificación y los procesos enzimáticos consecutivos. Para estos estudios comparativos, el ADN genómico se preparó utilizando la tecnología de purificación de centrifugado único GenElute™-E o la tecnología clásica de preparación de la centrifugación mediante unión a sílice, lavado y eluido, del proveedor X. La pureza del ácido nucleico se evaluó utilizando tres métodos:
- Espectrofotometría UV (cociente de densidad óptica media por A260nm/280nm y A260nm/230nm)
- Electroforesis en gel
- PCR cuantitativa (qPCR)
Los resultados indican que los sistemas de purificación de ADN y ARN de centrifugado único GenElute™-E proporcionan mayor pureza que las técnicas vigentes de preparación de columnas de sílice, lo que lleva a una cuantificación más precisa y a una menor interferencia de los contaminantes en los procesos enzimáticos posteriores, como la PCR.
Evaluación de las impurezas introducidas durante la preparación de los ácidos nucleicos
Interferencia en la cuantificación mediante espectrofotometría ultravioleta (UV)
Los contaminantes biológicos comunes de los protocolos de extracción y purificación, como proteínas, ácidos nucleicos fragmentados, ADN monocatenario, ARN (si se mide el ADN), cebadores y sales caotrópicas, pueden inducir una sobrevaloración de la concentración de ácidos nucleicos. Algunas de estas impurezas pueden medirse con espectrofotometría ultravioleta (UV). En este método, se hace pasar la luz UV a través de la muestra de ADN o ARN purificada. Se mide la absorbancia de la muestra a varias longitudes de onda.
La absorbancia a 260 nm (A260) se utiliza para medir los ácidos nucleicos. La absorbancia a 280 nm (A280) se utiliza para medir las proteínas contaminantes en la muestra. El cociente A260/A280 puede utilizarse para estimar la pureza de la muestra con respecto a los contaminantes proteicos. El ADN de gran pureza tendrá un cociente A260/A280 ≥ 1,8. Un cociente más bajo indica contaminación proteica en la preparación final.
La absorbancia a 230 nm (A230) se puede utilizar para identificar la presencia de contaminantes químicos, como las sales caotróficas. Lo ideal es que el cociente A260/A230 sea superior a 2,0 para una interferencia química mínima en procesos enzimáticos como la PCR. Es fundamental evaluar este cociente cuando se requieren muestras de gran pureza.
Se evaluaron el espectro de absorbancia, el cociente A260/280 y el cociente A260/230 para los sistemas de purificación de ADN y ARN de centrifugado único GenElute™-E utilizando muestras de sangre. Los resultados se compararon con los obtenidos tras la purificación mediante centrifugación en sílice de las mismas muestras utilizando un producto de la competencia (Figura 3 y Tabla 1). Los datos sugieren que los sistemas de purificación GenElute™-E proporcionan una mayor pureza del ADN genómico con menos contaminantes biológicos y químicos en la preparación final de la muestra en comparación con los métodos de preparación de unión a la sílice, lavado y eluido.
Figura 3.Espectros de absorción UV de ADN genómico preparado a partir de sangre utilizando A) kit de preparación para purificación de ADN mediante centrifugación basada en sílice del proveedor X o B) kits de purificación de ADN mediante cromatografía negativa y centrifugado único GenElute™-E. Gráfico insertado medido a diez veces la concentración de la fracción eluida. Sólo se detectan impurezas en las fracciones de elución de la sílice. Las líneas negras corresponden a los espectros de la muestra purificada utilizando el método indicado con cualquier efecto contaminante del proceso. Las líneas rojas son espectros de la muestra purificada sin contaminantes del proceso, que se utilizan como controles basales. Las líneas naranjas son espectros correspondientes al método de purificación sin utilizar una muestra real y demuestran el impacto de los contaminantes del proceso en la lectura espectrofotométrica.
ADN fragmentado e impurezas de ácidos nucleicos de bajo peso molecular evaluados mediante electroforesis en gel
La separación por tamaño mediante electroforesis en gel proporciona una evaluación visual y cuantitativa de la pureza de la muestra. El ADN genómico más grande migra más despacio que los fragmentos de ADN y ARN más pequeños. Las bandas resultantes se pueden observar o cuantificar utilizando un colorante fluorescente.
Las muestras de ADN purificado preparadas a partir de tejido hepático de ratón utilizando kits de preparación mediante centrifugación a base de sílice (Proveedor X) o cromatografía negativa con exclusión por tamaño (kits de purificación de ADN de un centrifugado único GenElute™-E) se separaron en un gel de agarosa. Se utilizó SYBR verde como colorante de los ácidos nucleicos. Para normalizar los resultados, se cargó en cada carril del gel la misma masa de ADN de cada muestra purificada. La visualización del gel de agarosa en un transiluminador demostró la obtención de bandas únicas más oscuras de ADN genómico mediante cromatografía negativa (exclusión por tamaño) en comparación con el método de purificación en sílice (Figura 4).
Las muestras eluidas de las columnas de centrifugado con membrana de sílice mostraron bandas más tenues en el extremo inferior del gel, lo que coincide con moléculas pequeñas de ARN o ADN fragmentado contaminantes en la preparación final. Debido a que la carga de gel se normalizó contra el ADN en la muestra (determinado por la absorbancia a 260 nm), estos datos sugieren que en este método se sobrevalora la producción de ADN genómico, ya que las moléculas contaminantes de ácidos nucleicos más pequeñas también contribuyen a la medición de absorbancia. La banda única de ADN de mayor intensidad obtenida con el método de cromatografía negativa GenElute™-E (exclusión por tamaño) sugiere una mayor pureza del ADN genómico procedente de estas muestras de tejido. Los resultados se cuantificaron utilizando métodos fluorométricos (Figura 5).
Figura 4.Electroforesis en gel de ADN genómico purificado a partir de muestras de tejido hepático de ratón. El tejido de ratón se purificó utilizando el método de centrifugación a base de sílice (proveedor X) o el método de cromatografía negativa mediante exclusión por tamaño (kits de purificación de ADN de centrifugado único GenElute™-E). Las muestras se ajustaron para que se cargara la misma cantidad de ADN en cada carril del gel de agarosa. Los resultados sugieren la presencia de ARN contaminante o ADN fragmentado en las muestras purificadas mediante el método a base de sílice.
Figura 5.Rendimiento calculado del ADN genómico (gDNA) y cantidades de ARN contaminante o ADN fragmentado de muestras de tejido hepático de ratón. Las muestras se purificaron utilizando métodos de centrifugación con sílice (proveedor X) o cromatografía negativa mediante exclusión por tamaño (kits de purificación de ADN de centrifugado único GenElute™-E). Las cantidades de ADN se calcularon cuantificando la señal fluorescente del colorante SYBR verde. Los resultados demuestran cantidades pequeñas pero significativas de ARN o ADN fragmentado contaminantes en las muestras preparadas con columnas de centrifugación para purificación con sílice.
Interferencia en la qPCR
Los métodos de purificación a base de sílice introducen sales desnaturalizantes y disolventes orgánicos como el etanol en la muestra que se está purificando. Estos contaminantes pueden transferirse fácilmente a las aplicaciones posteriores e inducir la inhibición de las reacciones enzimáticas. La eliminación de tales contaminantes puede aumentar la sensibilidad y robustez de los métodos enzimáticos, como la qPCR.
Para evaluar la presencia de contaminantes que inhiban los procesos enzimáticos, se purificó el ADN genómico de muestras renales de ratón utilizando cada método de purificación con centrífuga. Las muestras finales se utilizaron en experimentos de análisis de qPCR (Figura 6). También se amplificó el gen correspondiente a la beta-actina como control endógeno. Los datos demuestran que las curvas de amplificación de las muestras purificadas con sílice se desplazaron hacia la derecha en comparación con las muestras preparadas con el método de purificación de cromatografía negativa GenElute™-E (exclusión por tamaño). Esto sugiere la presencia de contaminantes interferentes o un rendimiento inferior al calculado en las muestras purificadas con sílice.
Figura 6.Análisis de qPCR para la determinación de contaminantes interferentes en preparaciones de ADN genómico. A) Curvas de amplificación para ADN genómico preparado a partir de tejido renal de ratón utilizando un kit de preparación mediante centrifugación a base de sílice del proveedor X (curvas azules) y un kit de preparación de centrifugado único mediante cromatografía negativa GenElute™-E (exclusión por tamaño) (curvas naranjas). Las curvas de las muestras purificadas con sílice se desplazan hacia la derecha en comparación con las muestras purificadas con GenElute™-E, lo que sugiere la presencia de contaminantes que interfieren o la sobrevaloración de la concentración de partida en las preparaciones de sílice. B) Cálculos de CQ utilizando el gen de la β-actina como referencia de control endógeno.
Conclusiones
Los kits de purificación de ADN y ARN de centrifugado único GenElute™-E proporcionan un práctico método de cromatografía negativa para la purificación de ácidos nucleicos basada en la exclusión por tamaño. Estos kits ofrecen una alternativa a las preparaciones tradicionales mediante centrifugación con sílice, con una pureza mejorada como ponen de manifiesto la espectrofotometría UV, la electroforesis en gel y la qPCR.
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