Optimierung der Aufreinigung von Histidin-markierten Proteinen

In diesem Kapitel werden drei Verfahren zur Optimierung der Aufreinigung von Histidin-markierten Proteinen erörtert, um eine hohe Reinheit zu erreichen:

• Optimierung mit Imidazol
• Optimierung mit verschiedenen Metallionen
• Optimierung durch mehrstufige Aufreinigungen

Allgemeine Informationen zur Aufreinigung von Histidin-markierten Proteinen, einschließlich typischer Workflows, Beschreibungen der verfügbaren Chromatographiemedien und Produktformate, Verfahren und Hinweise zur Fehlerbehebung, finden Sie in Kapitel 3.

Optimierung mit Imidazol

Das Vorhandensein Oberflächen-exponierter Histidinreste oder anderer komplexbildender Aminosäuren kann zu einer unerwünschten Bindung nicht markierter Wirtszellproteine an das Aufreinigungsmedium führen. Diese nicht markierten Proteine können mit dem Zielprotein eluieren. Die Bindungsaffinität dieser Verunreinigungen ist oft geringer als die der markierten rekombinanten Proteine; daher kann es möglich sein, sie durch Optimierung der Trennbedingungen zu entfernen.

In den nachstehenden Beispielen wird aufgezeigt, wie sich Änderungen der Imidazolkonzentration während der Bindung auf die Reinheit des Histidin-markierten Zielproteins auswirken.

Bei der Verwendung von Ni Sepharose^® Excel und TALON^® Superflow Produkten wird in der Regel nicht empfohlen, Imidazol in die Bindung zu integrieren.

1. Imidazol als kompetitives Agenz

Imidazol wird als kompetitives Agenz für die Elution von Histidin-markierten Proteinen verwendet. Darüber hinaus kann Imidazol in geringen Konzentrationen in den Proben- und Bindepuffer gegeben werden, um die Bindung verunreinigender Proteine zu verringern und so die finale Reinheit zu erhöhen.

Histidin-markierte Proteinkinase G [(His)6-PknG] aus Mycobacterium bovis wurde bei einer Konzentration von 45 mM Imidazol im Proben- und Bindepuffer aufgereinigt. Das im Versuch verwendete Medium war Ni Sepharose^® High Performance (Kapitel 3, Purification using Ni Sepharose^® High Performance)(Aufreinigung mit Ni Sepharose^® High Performance).

Um eine höhere Proteinkonzentration zu erreichen, wurde das Protein in einem Stufengradienten eluiert (Abbildung 4.1A). Um die vorteilhafte Wirkung von Imidazol während der Bindung zu demonstrieren, wurde eine zusätzliche Aufreinigung unter denselben Bedingungen durchgeführt, wobei das Imidazol weggelassen wurde (Abbildung 4.1B). Es ist wichtig zu beachten, dass das Weglassen von Imidazol für Ni Sepharose^® High Performance oder Ni Sepharose^® 6 Fast Flow im Allgemeinen nicht empfohlen wird; dieses Beispiel dient lediglich dazu, die negativen Auswirkungen seines Fehlens auf die Reinheit des eluierten Zielproteins zu demonstrieren.

Die SDS-PAGE der gepoolten Elutionsfraktionen zeigte eine deutliche Verbesserung der Reinheit des Zielproteins auf, wenn 45 mM Imidazol im Proben- und Bindepuffer enthalten war (Abbildung 4.1C). Die Ausbeute des Zielproteins wurde in diesem Fall in der Probe mit 45 mM Imidazol beibehalten. Bitte beachten Sie, dass die optimale Imidazolkonzentration proteinabhängig ist und daher von Fall zu Fall bestimmt werden muss.

Abbildung 4.1. Aufreinigung von (His)6-PknG ohne (A) und mit (B) 45 mM Imidazol im Proben- und Bindepuffer. Für jedes Chromatogramm wurde eine 2-ml-Ni-Sepharose® High Performance-Säule (XK 16/20-Säule) unter Verwendung des ÄKTApurifier-Chromatographiesystems (jetzt ersetzt durch ÄKTA pure) mit dem Lysat von 2 l einer E. coli-Kultur (Probenvolumen 26 ml; gefiltert durch einen 0,45-µm-Spritzenvorsatzfilter) beladen. Die Kinase wurde in einem zweistufigen Gradienten mit 50 % und 100 % Elutionspuffer eluiert. (C) SDS-PAGE (12 % Gel) von (His)6-PknG-Fraktionen mit Eluaten ohne (-) und mit (+) 45 mM Imidazol im Bindepuffer. Die Daten wurden freundlicherweise von K. Hölscher, M. Richter-Roth und B. Felden de Neuman von der GPC Biotech AG in Martinsried zur Verfügung gestellt.

2. Bestimmung der optimalen Imidazolkonzentration mit His SpinTrap

Die Imidazolkonzentration beim Binden und Waschen ist ein wichtiger Faktor für die endgültige Reinheit und Ausbeute des Zielproteins. His SpinTrap ist ein komfortables und schnelles Tool für die Bestimmung der optimalen Imidazolkonzentration. Die Optimierung ist sowohl für die Reinheit als auch für die Ausbeute des Zielproteins wichtig. Dies wurde durch eine Versuchsreihe demonstriert, in denen ein mit Histidin markiertes Protein, APB7-(His)₆ (M_r 28 000), auf His SpinTrap unter Verwendung von 5, 50, 100 oder 200 mM Imidazol in Proben- und Bindepuffern aufgereinigt wurde. Der Elutionspuffer enthielt 500 mM Imidazol.

Eine Imidazolkonzentration von 5 mM führte zu einer geringen Reinheit der eluierten Probe (Abbildung 4.2, Bahn 3), während durch eine Erhöhung auf 50 mM Imidazol die Bindung der meisten Verunreinigungen verhindert und die Reinheit verbessert wurde (Abbildung 4.2, Bahn 4). Durch die Aufnahme von 100 mM Imidazol in den Proben- und Bindepuffer wurde die Ausbeute verringert, während die Reinheit geringfügig verbessert wurde (Abbildung 4.2, Bahn 5). Die geringere Ausbeute lässt sich durch eine geringere Bindung des Zielproteins aufgrund der kompetitiven Wirkung der hohen Imidazolkonzentration in den Schritten Bindung und Waschen erklären. Durch eine weitere Erhöhung auf 200 mM Imidazol wurde die Ausbeute noch stärker reduziert (Abbildung 4.2, Bahn 6).

Dieses Beispiel macht deutlich, dass höhere Imidazolkonzentrationen während der Bindung die Reinheit verbessern, während durch eine zu hohe Konzentration die Ausbeute verringert wird. Die optimale Imidazolkonzentration während der Bindung ist proteinabhängig. Für viele Proteine sind 20 bis 40 mM Imidazol die beste Wahl für His SpinTrap.

Abbildung 4.2. SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (ExcelGel SDS-Gradient 8-18) des Histidin-markierten APB7-Proteins. Die Imidazolkonzentration während der Bindung wirkt sich auf die finale Reinheit und Ausbeute aus (vgl. Bahnen 3, 4, 5 und 6).

Optimierung mit verschiedenen Metallionen

Die Stärke der Bindung zwischen einem Protein und einem Metallion wird von mehreren Faktoren beeinflusst, darunter Struktur und Merkmale des Zielproteins, das Vorhandensein und die Eigenschaften des Protein-Affinitäts-Tags, die Eigenschaften des Metallions sowie der pH-Wert und die Zusammensetzung des Bindepuffers. Daher ist Ni²⁺, das Metallion mit der stärksten Affinität zu Histidin-markierten Proteinen, nicht immer die beste Wahl für eine gegebene Anwendung. In einigen Fällen sind daher andere Übergangsmetallionen, wie Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺ und Zn²⁺ besser geeignet.

Im Allgemeinen empfehlen wir für hohe Kapazitäten Ni Sepharose^® High Performance oder Ni Sepharose^® 6 Fast Flow Chromatographiemedien, die mit Ni²⁺ Ionen vorbeladen sind. Wenn eine erhöhte Selektivität und eine höhere Reinheit von Vorteil sind, ist TALON^® Superflow, das mit Co²⁺ vorbeladen ist, eine gute Wahl. Für eine veränderte Selektivität können andere Metallionen mit nicht beladener IMAC Sepharose^® High Performance oder IMAC Sepharose^® 6 Fast Flow getestet werden.

Die folgenden Leitlinien können für Vorversuche verwendet werden, um das Metallion auszuwählen, das für eine bestimmte Trennung am besten geeignet ist:

• Ni²⁺ wird im Allgemeinen für rekombinante Proteine mit Histidin-Markierung verwendet.

• Co²⁺ wird ebenfalls für die Aufreinigung von Histidin-markierten Proteinen verwendet, da es eine schwächere Bindung ermöglicht und die Menge an Verunreinigungen, die sich binden können, reduziert.

• Cu²⁺ und Zn²⁺ werden häufig für die Aufreinigung nicht markierter Proteine verwendet. Cu²⁺ bewirkt eine relativ starke Bindung an verschiedene Proteine, manche Proteine binden nur an Cu²⁺. Zn²⁺ Ionen binden oft schwächer, eine Eigenschaft, die häufig eingesetzt wird, um eine selektive Elution des Zielproteins zu erreichen. Sowohl Cu²⁺ als auch Zn²⁺ können für Histidin-markierte Proteine und Trennungen im Prozessmaßstab verwendet werden.

• Fe³⁺ wird seltener verwendet als andere Metallionen. Bei der Arbeit mit Fe³⁺ sind besondere Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, da es sich in neutralen Lösungen leicht reduziert. Fe³⁺ wird häufig zur Aufreinigung von Phosphopeptiden verwendet, da die Phosphatgruppe eine starke Affinität zu Fe³⁺ aufweist. Die Chromatographie mit immobilisiertem Fe³⁺ soll bei einem pH-Wert < 3 durchgeführt werden, damit unspezifische Wechselwirkungen mit Carboxylgruppen vermieden werden. Wir empfehlen außerdem, immobilisierte Fe³⁺ Ionen nach jedem Lauf zu strippen und die Säule bei Bedarf neu zu beladen. Stark gebundene Fe³⁺ Ionen und Eisenverbindungen können entfernt werden, indem das Medium über Nacht in 50 mM EDTA eingelegt wird.

Nachstehend werden zwei Beispiele vorgestellt, in denen deutlich wird, wie die Auswahl des am besten geeigneten Metallions und der Versuchsbedingungen (einschließlich der Imidazolkonzentration) die Aufreinigung eines bestimmten Zielproteins beeinflusst.

1. Vergleichsstudie ²⁺, Zn²⁺ und Ni²⁺ auf HiTrap IMAC FF mit Cu

In dieser Studie wurde APB7, ein (Histidin)₆ markiertes Protein (M_r 28 000), das in E. coli BL-21 exprimiert wird, auf HiTrap IMAC FF 1-ml-Säulen (vorgepackt mit IMAC Sepharose^® 6 Fast Flow) aufgereinigt und separat mit Cu²⁺, Zn²⁺ und Ni²⁺ beladen.

Es wurden Screening-Versuche durchgeführt, um die optimale Imidazolkonzentration für jedes Ion zu bestimmen [Abbildung 4.3 (A bis C)]. Die Ergebnisse dieser drei Aufreinigungen sind wie folgt:

• Bei 20 mM Imidazol kam es beim Waschen mit Cu²⁺ und Zn²⁺ zu einem signifikanten Austritt von Zielprotein (Pfeile in Abbildung 4.3 A). Dies ist ein Anzeichen dafür, dass die Imidazolkonzentration zu hoch war, um eine maximale Ausbeute zu ermöglichen. Bei Ni²⁺ wurde nur ein sehr geringer Austritt festgestellt. Die Reinheit war in allen drei Fällen ausgezeichnet.

• Bei 10 mM Imidazol war der Austritt des Zielproteins im Waschvorgang bei Cu²⁺ und Zn²⁺ deutlich reduziert. Die Reinheit des Zielproteins im eluierten Pool war bei allen drei Metallionen ähnlich, aber nicht so rein wie mit 20 mM Imidazol.

• Bei 5 mM Imidazol trat bei keinem der Metallionen eine Leckage auf. Ni²⁺ lieferte das reinste Protein, jedoch nicht so rein, wie es bei 20 mM Imidazol der Fall war.

Beachten Sie, dass eine große Menge der Probe in das SDS-Polyacrylamid-Gel gegeben wurde. Aus diesem Grund weisen die Gele eine Reihe von Verunreinigungen im eluierten Material auf, obwohl die Reinheit sehr hoch war.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Imidazolkonzentration für jedes beliebige Metallion so eingestellt werden kann, dass eine hohe Ausbeute, eine hohe Reinheit oder ein erfolgreicher Kompromiss erzielt wird. IMAC Sepharose^® Medien erfordern in der Regel eine etwas höhere Imidazolkonzentration im Waschpuffer als ähnliche auf dem Markt befindliche IMAC-Medien. Ein guter Ausgangspunkt für die meisten Trennungen ist die Zugabe von 20 bis 40 mM Imidazol in die Binde- und Waschpuffer bei Verwendung von IMAC Sepharose^® 6 Fast Flow oder IMAC Sepharose^® High Performance. Es ist wichtig, hochreines Imidazol zu verwenden, das bei 280 nm praktisch keine Extinktion aufweist. Um Imidazol aus dem Protein zu entfernen, eine Entsalzungssäule verwenden (Kapitel 11, Desalting/Buffer Exchange and Concentration) (Entsalzung/Pufferaustausch und Konzentrierung).

Abbildung 4.3. SDS-PAGE-Analysen (Reduktionsbedingungen) von Fraktionen aus der Aufreinigung von APB7 unter Verwendung von IMAC Sepharose® 6 Fast Flow, vorgepackt in HiTrap IMAC FF 1-ml-Säulen, beladen entweder mit Cu2+, Zn2+ oder Ni2+ und mit (A) 20 mM Imidazol in der Probe, (B) 10 mM Imidazol in der Probe oder (C) 5 mM Imidazol in der Probe. Die Gele wurden mit Coomassie gefärbt.

2. Optimierung der Reinheit von o²⁺, Zn²⁺, Co²⁺ und Ni²⁺ auf HiTrap IMAC HPf mit Cu

Für eine erfolgreiche Aufreinigung müssen die Eigenschaften des Zielproteins und die Affinität des Zielproteins zum verwendeten Metallion berücksichtigt werden. Vier verschiedene HiTrap IMAC HP 1-ml-Säulen, die mit IMAC Sepharose^® High Performance vorgepackt waren, wurden separat mit vier verschiedenen Metallionen beladen: Cu²⁺, Zn²⁺, Co²⁺ und Ni²⁺. Die Reinigungsleistung wurde anhand des in E. coli exprimierten Zielproteins APB7 (M_r 28 000) bewertet.

Die Ergebnisse machen deutlich, wie wichtig das Screening von Proben ist, wenn es darum geht, die am besten geeigneten Metallionen und Aufreinigungsbedingungen für bestimmte Zielproteine zu bestimmen. Für APB7 wurde die höchste Reinheit mit Ni²⁺ oder Co²⁺ erreicht, aber der Unterschied zu den Ergebnissen für Zn²⁺ und Cu²⁺ war nur geringfügig (Abbildung 4.4). Die in diesen Beispielen verwendeten Gradientenelutionen mit Imidazol bieten auch eine Methode zur Auswahl der geeigneten Imidazolkonzentration für eine gegebene Aufreinigung.

Abbildung 4.4. Aufreinigung von APB7, einem (Histidin)6-markierten Proteins, das in E. coli BL-21 exprimiert wird, auf vier verschiedenen HiTrap IMAC HP 1-ml-Säulen, die separat mit Metallionen beladen sind. (A) Cu2+, (B) Zn2+, (C) Co2+ oder (D) Ni2+. Pools, die nach der SDS-PAGE einzelner 1-ml-Fraktionen (nicht dargestellt) ausgewählt wurden, sind angegeben. (E) SDS-PAGE-Analyse: reduzierende Bedingungen auf ExcelGel SDS Gradient 8-18; Coomassie-Färbung.

Optimierung durch mehrstufige Aufreinigungen

Wie in den nachfolgenden Beispielen deutlich wird, kann das Zielprotein durch einen oder mehrere zusätzliche Aufreinigungsschritte weiter aufgereinigt werden. Dieses Thema wird in Kapitel 9 (Affinity chromatography in a purification strategy (C_IPP)) (Affinitätschromatographie in einer Aufreinigungsstrategie (C_IPP) ausführlich behandelt.

Im Folgenden stellen wir zwei Beispiele für eine erfolgreiche mehrstufige Aufreinigung der Zielproteine vor.

1. Zweistufige Aufreinigung eines ₁₀-markierten Proteins unter Verwendung von hochmolekularem AC und SECa (Histidin)

Bei der zweistufigen Aufreinigung von (His)₁₀-trx-p450 (Histidin-markiert am N-Terminus, 10 Histidinreste), das in E. coli hergestellt wurde, wurde im ersten Schritt eine HisTrap FF-Säule verwendet. Der eluierte Pool wurde dann auf einer HiLoad 16/60 Superdex 200 pg-Säule zur weiteren Aufreinigung durch SEC angewendet.

Nach dem ersten Aufreinigungsschritt wurden drei Hauptbanden festgestellt (Abbildung 4.5B, Bahn 5). Bahn 6 (Pool 2 aus SEC) enthält das Zielprotein in voller Länge. Die Bahnen 7 und 8 (Pools 3 bzw. 4) enthalten verkürzte Formen des Zielproteins, wie durch N-terminale Sequenzierung verifiziert (Daten nicht dargestellt). Bahn 9 (Pool 1) von SEC enthält aggregierte Proteine. Die anschließende SEC ermöglichte eine sehr gute Trennung zwischen den verkürzten Formen und dem Zielprotein in voller Länge, (His)₁₀-trx-p450.

Abbildung 4.5. (A) Zweistufige Aufreinigung eines hochmolekularen (Histidin)10-markierten Proteins mit AC und anschließender SEC. (B) SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen und Coomassie-Färbung.

2. Automatische dreistufige Aufreinigung von nicht geklärtem Zelllysat auf ÄKTAxpress

Es wurde ein automatisiertes dreistufiges Protokoll eingesetzt, um das Histidin-markierte Maltose-Bindeprotein aus 100 ml eines nicht geklärten E. coli-Zelllysats aufzureinigen. Die drei Schritte waren: Affinitätschromatographie (AC) mit HisTrap FF crude (1-ml-Säule), Entsalzung (DS) mit HiPrep 26/10 Entsalzung und Ionenaustauschchromatographie (IEX) mit Mono Q™ 5/50 GL. Diese werden in der Abbildung als AC-DS-IEX bezeichnet. Wie aus der SDS-PAGE-Analyse hervorgeht, wurde das Zielprotein mit hoher Reinheit und Ausbeute gewonnen.

Abbildung 4.6. (A) AC-DS-IEX mit einer Vergrößerung der IEX-Peaks und den gesammelten Pools auf der rechten Seite. Ausbeute: 9,4 mg in den Pools 1 + 2. (B) SDS-PAGE von eluierten Pools aus IEX. Das Gel wurde mit Coomassie gefärbt.