Einführung in SDS-PAGE – Auftrennung von Proteinen nach Größe

Polyacrylamidgele werden durch die Umsetzung von Acrylamid mit Bis-Acrylamid (N,N‘-Methylenbisacrylamid) gebildet, die zu einer hochgradig vernetzen Gelmatrix führt. Das Gel wirkt wie ein Sieb, durch das sich die Proteine in Reaktion auf das elektrische Feld bewegen. Proteine haben eine positive oder negative Gesamtladung. Dies ermöglicht die Bewegung eines Proteinmoleküls zu einem isoelektrischen Punkt. An diesem Punkt weist das Molekül keine Nettoladung auf. Durch die Denaturierung der Proteine und indem ihnen eine gleichmäßige negative Ladung verliehen wird, ist es möglich, sie bei der Migration zur positiven Elektrode basierend auf der Größe zu trennen.

Abbildung 1. SDS-PAGE von Proteinproben und ColorBurst-Proteinmarker (C1992)

Protokoll

Erforderliche Materialien und Reagenzien

• Vertikale Elektrophoresekammer mit Energieversorgung, Glasplatten, Abstandshaltern und Kämmen

Benötigte Reagenzien	Reagenzbestandteile	Produktnummer
Acrylamid/Bis-Acrylamid-Lösung	Acrylamid  29,2 g Bis-Acrylamid 0,8 g	01696 M7279
Gelgießpuffer	1.5 M Tris-HCl, pH 8,8 (zur Vorbereitung des Trenngels): 18,15 g Tris-Base werden in 80 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Der pH-Wert wird mit 6N HCl auf 8,8 eingestellt. Das Endvolumen wird mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt. 0.5 M Tris-HCl, pH 6,8 (zur Vorbereitung des Sammelgels): 6 g Tris-Base werden in 80 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Der pH-Wert wird mit 6N HCl auf 6,8 eingestellt. Das Endvolumen wird mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt.	93362
2X Laemmli-Ladepuffer	Bromophenolblau 0,004 % 2-Mercaptoethanol 10 % Glycerin 20 % SDS 4% Tris-HCl 0,125 M	B5525 M3148 G5516 L3771 93362
10X Laufpuffer	Tris-HCl 25 mM Glycin 200 mM SDS 0,1 % (w/v)	93362 G8898 L3771
10 % SDS	SDS	L3771
10 % Ammoniumpersulfat	Ammoniumpersulfat	A3678
TEMED	TEMED	T9281

HINWEIS: Acrylamid und Bis-Acrylamid sind von Natur aus neurotoxisch. Beim Durchführen aller Schritte sollten puderfreie Handschuhe getragen werden.

Herstellung von Gel

• Die Glasplatten und Abstandshalter der Gelgießeinheit werden mit entionisiertem Wasser und Ethanol gereinigt.
• Die Platten mit den Abstandshaltern werden auf einer stabilen, ebenen Oberfläche angeordnet.
• Die Gel-Trennlösung wird abhängig vom erforderlichen Gelanteil mit folgenden Volumina (für 10 ml) hergestellt.

Gel %	Wasser (ml)	30 % Acrylamid (ml)	1.5 M Tris-HCl, pH 8,8 (ml)	10 % SDS (µl)	10 % APS (µl)	TEMED*(µl)
8 %	4,6	2,6	2,6	100	100	10
10 %	3,8	3,4	2,6	100	100	10
12 %	3,2	4,0	2,6	100	100	10
15%	2,2	5,0	2,6	100	100	10
* TEMED muss der letzte Inhaltsstoff sein, der hinzugefügt wird.

• Die Gellösung wird in die mit den Abstandshaltern angeordneten Platten gegossen. Um eine gleichmäßige und horizontale Oberfläche des Trenngels zu erhalten, kann die Oberfläche mit Wasser oder Isopropanol (I9516) bedeckt werden.
  
• Das Gel etwa 20-30 Minuten bei Raumtemperatur aushärten lassen.
  
• Die Sammelgellösung wird mit den folgenden Volumina (für 10 ml) hergestellt:
  

Gel %	Wasser (ml)	30 % Acrylamid (ml)	0.5 M Tris-HCl, pH 6,8 (ml)	10 % SDS (µl)	10 % APS (µl)	TEMED*(µl)
5 %	5,86	1,34	2,6	100	100	10

* TEMED muss der letzte Inhaltsstoff sein, der hinzugefügt wird.

• Das übergelagerte Wasser oder Isopropanol auf dem Trenngel wird verworfen
• Es werden 5% Sammelgellösung hinzugegeben, bis diese überläuft. Den Kamm sofort einsetzen und sicherstellen, dass keine Luftblasen im Gel oder in der Nähe der Wells eingeschlossen sind.
• Das Gel etwa 20-30 Minuten bei Raumtemperatur aushärten lassen.
  

Probenvorbereitung

• Einem Volumen der Proteinprobe (Zell- oder Gewebelysat) wird das gleiche Volumen Ladepuffer zugesetzt.
  
• Diese Mischung 5 Minuten bei 95 °C kochen. 5 Minuten bei 16000 xg zentrifugieren.
  
• Diese Proben können bei -20 °C gelagert oder für die Gelelektrophorese verwendet werden.

Gelfärbung

Coomassie-Blau-Färbung: Die Färbung von Proteingelen mit Coomassie-Brillantblau R-250 ist ein gängiges Verfahren zur Visualisierung von Proteinen, die durch SDS-PAGE getrennt wurden. Es ist hochempfindlich und eignet sich für die Langzeitlagerung der Gele.

Benötigte Reagenzien

• Gel-Fix-Lösung (500 ml)
  
       Methanol (M3641) 250 ml
       Eisessig (695092) 50 ml
       Wasser 200 ml
  
  
• Coomassie-Lösung
  
       CBB R-250 (B6529) 0,1 %
       Methanol (M3641) 40 %
       Eisessig (695092) 10 %
       Die Färbelösung durch Whatmann-Filterpapier Nr. 1 filtern.
  
  
• Entfärbelösung
  
  Methanol (M3641) 50 ml
  Eisessig (#695092) 35 ml
  
  
• Gel-Aufbewahrungslösung
  
  Eisessig (695092) 25 ml
  Wasser 475 ml

Durchführung

• Nach der Elektrophorese wird das Gel in einen Kunststoffträger mit Gel-Fix-Lösung gelegt. Der Träger wird auf einen Rütteltisch gestellt und die Proteine 2 Stunden fixiert.
  
• Die Gel-Fix-Lösung wird entfernt und Coomassie-Lösung hinzugefügt.  Auf einen Rütteltisch legen und das Gel 2-4 Stunden lang färben.
  
• Das Gel wird nach dem Färbeschritt mehrmals mit destilliertem Wasser gewaschen, um überschüssige Färbemittel zu entfernen.
  
• Entfärbelösung auf das Gel geben. Auf einen Rütteltisch legen und etwa 4 Stunden entfärben, bis klare blaue Banden auf klarem Hintergrund zu sehen sind.
  
• Nach dem Entfärben können die Gele in einer Gel-Aufbewahrungslösung gelagert und nach Bedarf fotografiert werden.

Silberfärbung

Wir bieten ein hochempfindliches Kit für die Silberfärbung, das für SDS-PAGE-Gele geeignet ist, zum Nachweis von Proteinen an. Die folgenden Reagenzien werden zusätzlich benötigt:

• Fixierlösung
  
       Ethanol (E7023) 50 ml
       Essigsäure 10 ml
       Wasser 40 ml
  
  
• 30 % Ethanol (E7023) Lösung

Durchführung

• Nach dem Elektrophoreselauf wird das Gel für 40 Minuten in Fixierlösung eingetaucht. Ein Eintauchen in Fixierlösung über Nacht führt zu einem klareren Hintergrund.
  
• Die Fixierlösung wird entfernt und das Gel 10 Minuten mit einer 30 % Ethanollösung und anschließend 10 Minuten mit Reinstwasser gewaschen.
  
• Das Wasser wird dekantiert und das Gel 10 Minuten in der Sensibilisierungslösung inkubiert.
  
• Die Sensibilisierungslösung wird entfernt und das Gel zweimal mit Wasser gewaschen, wobei jeder Waschvorgang 10 Minuten dauert.
  
• Das Wasser wird dekantiert und das Gel 10 Minuten in die Silberlösung getaucht.
  
• Die Silberlösung wird dekantiert und das Gel 1,5 Minuten in Wasser gewaschen.
  
• Das Wasser wird verworfen und das Gel 3 bis 7 Minuten in die Entwicklerlösung getaucht.
  
• 5 ml Stopplösung zur Entwicklerlösung geben und 5 Minuten inkubieren. Die Entwickler-/Stopplösung wird entfernt und das Gel 15 Minuten in Reinstwasser gewaschen.
  
• Das Gel kann fotografiert und auch in frischem Reinstwasser aufbewahrt werden.

Für eine Doppelfärbung wird das Gel mit CBB R-250 und anschließend mit einer Silberfärbung nach dem vorgenannten Verfahren gefärbt.

Fluoreszenzfärbungen: Wir bieten fluoreszierende SYPRO- und Lucy-Färbungen für die Proteinelektrophorese an. Die Gele können entweder im Dunkeln in den Fluoreszenzfarbstoff getaucht werden oder das Gel kann während der Elektrophorese mit Kathodenpuffer gemischt werden.

Die Färbeprotokolle hängen von der verwendeten Färbung ab und können hier eingesehen werden:

• SYPRO^® Ruby Protein Gel Stain (PDF)
  
• LUCY^® 506 Solution (PDF)
  

Reversible Gelfärbung

Reversible Gelfärbungen ermöglichen es dem Benutzer, nach der SDS-PAGE ein Western Blotting der Proteine durchzuführen.

R-PROB-Färbung: R-PROB ist eine einzigartige Färbung zum Nachweis von Proteinen auf PAGE-Gelen und Western Blots.

Benötigte Reagenzien:

• Reversibles Protein-Nachweiskit für Membranen und Polyacrylamidgele (RPROB)
  
• Fixierlösung (F7264)
  
• 10 % Essigsäure
  
• EDTA 50 mM

Durchführung

• Die Gele werden nach der Elektrophorese für 20 Minuten in Fixierlösung eingetaucht. Der Schritt wird zweimal wiederholt.
  
• Das Gel wird zweimal mit Wasser gespült, wobei jeder Waschvorgang 30 Minuten dauert.
  
• Das Gel wird unter leichtem Schütteln 20-40 Minuten in Färbelösung inkubiert.
  
• Überschüssige Färbung wird mit 10 % Essigsäure abgewaschen.
  
• Zur Entfärbung wird das Gel mit EDTA gewaschen, gefolgt von zwei Waschvorgängen von je 15 Minuten in Wasser oder Fixierlösung.

Kupferfärbung: Um die Migration und Trennung der Proteine zu bestätigen, kann das Gel mit einer reversiblen Färbung wie CuCl₂ gefärbt werden.

Benötigte Reagenzien

• 0,3 M CuCl₂ Lösung
  
• 0,25 M Tris und 0,25 M EDTA-Lösung

Durchführung

• Die Gele nach der Elektrophorese in destilliertem Wasser maximal 30 Minuten spülen.
  
• Das Gel 10 Minuten in 0,3 M CuCl₂ Lösung tauchen.
  
• Mit entionisiertem Wasser spülen.
  
• Die Proteine sind als klare Zonen auf blauem Hintergrund zu erkennen.
  
• Um das Gel für den Western Blot vollständig zu entfärben, werden die gefärbten Gele wiederholt in 0,25 M Tris und 0,25 M EDTA-Lösung, pH 9, gewaschen.
  
• Das entfärbte Gel wird in den Transferpuffer gelegt, bevor mit dem Transfer-Setup fortgefahren wird.

Abbildung 2. Blotting und vertikales Elektrophorese-System

Wenn der Transfer von Proteinen auf eine Membran nach der Elektrophorese gewünscht wird, finden Sie das Protokoll hier.

Literatur

1. Sambrook J, Fritsch T, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.