ELISA-Protokolle

Diese Protokolle sind nur für den allgemeinen Gebrauch als Leitfaden gedacht. Weitere Informationen finden Sie im detaillierten Protokoll des jeweiligen ELISA-Kits auf der Produktdetailseite. Durchsuchen Sie alle ELISA-Kits auf unserer ELISA-Hub-Seite.

• Sandwich-Assay-Verfahren
• Phosphorylierungs-Assay-Verfahren
• EIA-Assay-Verfahren
• Zellbasierte Assay-Verfahren

Sandwich-Assay-Verfahren

1. Alle Reagenzien und Proben vor der Verwendung auf Raumtemperatur (18 – 25 °C) bringen. Es wird empfohlen, alle Standards und Proben mindestens in zweifacher Ausfertigung durchlaufen zu lassen.
2. Jeweils 100 µl jedes Standards und jeder Probe in die entsprechenden Wells geben. Die Wells abdecken und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln inkubieren.
3. Die Lösung verwerfen und viermal mit 1X Waschlösung waschen. Waschen, indem jedes Well mit einer Mehrkanalpipette oder einem Autowasher mit Waschpuffer (300 µl) gefüllt wird. Die vollständige Entfernung der Flüssigkeit bei jedem Schritt ist für eine gute Leistung unerlässlich. Nach dem letzten Waschvorgang die Reste des Waschpuffers durch Absaugen oder Dekantieren entfernen. Die Platte umdrehen und auf sauberen Papiertüchern abtupfen.
4. 100 µl des 1x vorbereiteten Detektionsantikörpers in jedes Well geben. Wells abdecken und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren.
5. Die Lösung verwerfen. Den Waschvorgang, wie in Schritt 3 beschrieben, wiederholen.
6. 100 µl der vorbereiteten Streptavidinlösung in jedes Well geben. Die Wells abdecken und 45 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren.
7. Die Lösung verwerfen. Den Waschvorgang, wie in Schritt 3 beschrieben, wiederholen.
8. 100 µl TMB One-Step Substratreagenz (Artikel H) in jedes Well geben. Die Wells abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln unter leichtem Schütteln inkubieren.
9. 50 µl der Stopplösung (Artikel I) in jedes Well geben. Die Extinktion bei 450 nm sofort ablesen.

Phosphorylierungs-Assay-Verfahren

1. Alle Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur (18 – 25 °C) bringen. Es wird empfohlen, alle Proben oder Positivkontrollen mindestens in zweifacher Ausfertigung durchlaufen zu lassen.
2. Jeweils 100 µl der Probe oder Positivkontrolle in die entsprechenden Wells geben. Die Wells mit dem Plattenhalter abdecken und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C unter Schütteln inkubieren.
3. Die Lösung verwerfen und viermal mit 1x Waschlösung waschen. Waschen, indem jedes Well mit einer Mehrkanalpipette oder einem Autowasher mit Waschpuffer (300 µl) gefüllt wird. Die vollständige Entfernung der Flüssigkeit bei jedem Schritt ist für eine gute Leistung unerlässlich. Nach dem letzten Waschvorgang die Reste des Waschpuffers durch Absaugen entfernen. Die Platte umdrehen und auf sauberen Papiertüchern abtupfen.
4. 100 µl des vorbereiteten 1X biotinylierten Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers in jedes Well geben. 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubieren.
5. Die Lösung verwerfen. Den Waschvorgang, wie in Schritt 3 beschrieben, wiederholen.
6. 100 µl der vorbereiteten 1X HRP-Streptavidin-Lösung (siehe Reagenzienvorbereitung Schritt 6) in jedes Well geben. 45 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubieren.
7. Die Lösung verwerfen. Den Waschvorgang, wie in Schritt 3 beschrieben, wiederholen.
8. 100 µl TMB One-Step Substratreagenz (Artikel H) in jedes Well geben. 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln unter Schütteln inkubieren.
9. 50 µl der Stopplösung (Artikel I) in jedes Well geben. Sofort bei 450 nm ablesen.

EIA-Assay-Verfahren

1. Die Reagenzien des Kits während der Reagenzvorbereitung auf Eis aufbewahren. Es wird empfohlen, alle Standards und Proben mindestens in zweifacher Ausfertigung durchlaufen zu lassen.
2. 100 μl Anti-"Ziel"-Antikörper in jedes Well geben. 1,5 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln (1-2 Zyklen/sec) inkubieren. Alternativ über Nacht bei 4 °C inkubieren.
3. Die Lösung verwerfen und die Wells viermal mit 1x Waschpuffer (je 200-300 μl) waschen. Das Waschen kann mit einer Mehrkanalpipette oder einem automatischen Plattenwaschgerät erfolgen. Die vollständige Entfernung von Flüssigkeit bei jedem Schritt ist für eine gute Assayleistung unerlässlich. Nach dem letzten Waschvorgang die Reste des Waschpuffers durch Absaugen oder Dekantieren entfernen. Die Platte umdrehen und auf sauberen Papiertüchern abtupfen.
4. Je 100 μl jedes Standards, der Positivkontrolle und der Probe in die entsprechenden Wells geben. Darauf achten, dass ein Blindproben-Well vorhanden ist (nur Assay-Verdünnungsmittel). Die Wells abdecken und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln (1-2 Zyklen/sec) oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
5. Die Lösung verwerfen und viermal, wie in Schritt 3 beschrieben, waschen.
6. 100 μl der vorbereiteten HRP-Streptavidinlösung in jedes Well geben. 45 Minuten unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur inkubieren. Es wird empfohlen, dass die Inkubationszeit nicht kürzer oder länger als 45 Minuten ist.
7. Die Lösung verwerfen und viermal, wie in Schritt 3 beschrieben, waschen.
8. 100 μl TMB One-Step Substratreagenz (Artikel H) in jedes Well geben. 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln unter leichtem Schütteln (1-2 Zyklen/sec) inkubieren.
9. 50 μl der Stopplösung (Artikel I) in jedes Well geben. Sofort die Extinktionen bei 450 nm ablesen.

Zellbasierte Assay-Verfahren

HINWEIS: Alle Inkubations- und Waschschritte müssen unter leichtem Schütteln oder Rotieren (~1-2 Zyklen/sec) durchgeführt werden.

1. Den Versuch planen.
   OPTIONAL: Wenn HUVEC, HMEC-1 oder andere lose anhaftende Zellen ausgesät werden, die unbeschichtete 96-Well-Mikrotiterplatte (ARTIKEL A), beschichten, indem 100 μl Poly-L-Lysin (empfohlene Sigma-Aldrich-Produktnummer P4832) in jedes Well gegeben und dann die Anweisungen des Herstellers befolgt werden. Anstelle von ARTIKEL A kann eine vorbeschichtete CellBIND^® Mikrotiterplatte oder eine andere mit Polylysin behandelte Gewebekulturplatte verwendet werden.
2. 100 μl von 10.000 bis 30.000 Zellen in jedes Well der mitgelieferten unbeschichteten 96-Well-Mikrotiterplatte (ARTIKEL A) aussäen und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
   HINWEIS: Die optimale Zellzahl hängt von der Zelllinie und dem relativen Ausmaß der Proteinphosphorylierung ab. Es können mehr oder weniger Zellen verwendet werden, dies muss jedoch empirisch ermittelt werden. HINWEIS: Die Zellen können vor der Behandlung mit Inhibitoren oder Aktivatoren ~4-24 Stunden (abhängig von der Zelllinie) ausgehungert werden.         
3. Verschiedene Behandlungen, Inhibitoren (wie siRNA oder Chemikalien) oder Aktivatoren gemäß den Anweisungen des Herstellers anwenden und für die gewünschten Zeitpunkte inkubieren. 
   HINWEIS: Es wird empfohlen, Inhibitoren oder Aktivatoren vor der Behandlung der Zellen in serumfreiem Zellkulturmedium aufzulösen (sofern in den Anweisungen des Herstellers nicht anders angegeben)       
4. Das Zellkulturmedium verwerfen, indem die Mikrotiterplatte umgedreht und der Boden der Mikrotiterplatte vorsichtig über einem Waschbecken ausgeklopft wird.
5. Waschen durch Pipettieren von 200 μl des vorbereiteten 1X Waschpuffers A (ARTIKEL B) in jedes Well. Den Waschpuffer (wie in Schritt 4) verwerfen und 2 weitere Male in insgesamt 3 Waschvorgängen waschen, wobei jedes Mal frischer Waschpuffer verwendet wird. Die Mikrotiterplatte nach dem letzten Waschvorgang vorsichtig auf einem Papiertuch abtupfen, um überschüssigen/verbleibenden Puffer zu entfernen.
   HINWEIS: Um Zellverluste zu vermeiden, nicht direkt auf die Zellen pipettieren. Die Flüssigkeit stattdessen vorsichtig auf die Wand der Zellkultur-Wells geben. Darüber hinaus beim Verwerfen einer Lösung die Verwendung eines Vakuumsaugers oder ein zu starkes Klopfen auf die Mikrotiterplatte vermeiden.       
6. 100 μl Fixierlösung (ARTIKEL D) in jedes Well geben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   HINWEIS: Die Fixierlösung wird zur Permeabilisierung der Zellen verwendet.  
7. Waschschritt 5 wiederholen.
8. 200 μl des vorbereiteten 1X Quench-Puffers (ARTIKEL E) in jedes Well geben und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   HINWEIS: Der Quench-Puffer wird verwendet, um die Hintergrundreaktion zu minimieren.  
9. Viermal mit 1X Waschpuffer A waschen.
10. 200 μl des vorbereiteten 1X Blockierungspuffers (ARTIKEL F) in jedes Well geben und 1 Stunde bei 37 °C inkubieren. 
    
11. Dreimal mit dem vorbereiteten 1X Waschpuffer B (ARTIKEL C) waschen.
    HINWEIS: Bei Bedarf kann die Mikrotiterplatte nach diesem Waschvorgang mehrere Tage bei -80 °C gelagert werden.
12. 50 μl des vorbereiteten 1X Primärantikörpers (ARTIKEL G-1, G-2, G-3, H-1, H-2 oder H-3) in die entsprechenden Wells geben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.
13. Viermal mit 1X Waschpuffer B waschen.
14. 50 μl des vorbereiteten 1X HRP-konjugierten Sekundärantikörpers (ARTIKEL I-2) in jedes Well geben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
15. Schritt 13 wiederholen.
16. 100 μl des TMB-Substrats (ARTIKEL J) in jedes Well geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
17. 50 μl der Stopplösung (ARTIKEL K) in jedes Well geben. Sofort bei 450 nm ablesen.