Protokoll Restriktionsenzymverdau

Unsere Restriktionsenzymsammlung wurde für den Verdau mit fünf einzigartigen Puffern optimiert. Beim DNA-Verdau mit einem einzelnen Enzym den mit dem Enzym gelieferten Puffer verwenden.

Protokoll für den DNA-Verdau mit einem einzelnen Restriktionsenzym

1. Die Komponenten in der angegebenen Reihenfolge in ein sauberes Röhrchen geben:
        1 µl DNA (Konzentration 1 µg/µl)
   2 µl 10x-Puffer
   1 µl Restriktionsenzym
   16 µl steriles Wasser
   
2. Die Reaktion eine Stunde bei Verdautemperatur (üblicherweise 37 °C) inkubieren.
3. Den Verdau durch Wärme-Inaktivierung (65 °C über 15 Minuten) oder Zugabe von 10 mM EDTA-Endkonzentration beenden.
4. Die verdaute DNA kann für Forschungszwecke verwendet werden.

Wenn zwei Restriktionsenzyme gleichzeitig verwendet werden, zunächst die Enzymaktivitäten in jedem Puffer anhand der Tabelle in der Pufferreferenz für Restriktionsenzyme prüfen. Wenn beide im gleichen Puffer eine Aktivität von 100 % aufweisen, kann mit dem Doppelverdauungsprotokoll in diesem Puffer fortgefahren werden. Alternativ kann der optimale Puffer auch anhand der Tabelle der üblichen Doppelverdauungen ermittelt werden. In einigen Fällen wird ein sequenzieller Verdau aufgrund von Pufferunverträglichkeiten (Zusammensetzung oder Temperatur) empfohlen.

Protokoll für den DNA-Verdau mit zwei Restriktionsenzymen

1. Die Komponenten in der angegebenen Reihenfolge in ein sauberes Röhrchen geben:
        1 µl DNA (Konzentration 1 µg/µl)
   2 µl 10x-Puffer
   je 1 µl Restriktionsenzym
   15 µl steriles Wasser
   
2. Die Reaktion eine Stunde bei Verdautemperatur (üblicherweise 37 °C) inkubieren.
3. Den Verdau durch Wärme-Inaktivierung (65 °C über 15 Minuten) oder Zugabe von 10 mM EDTA-Endkonzentration beenden.
4. Die verdaute DNA kann für Forschungszwecke verwendet werden.

Protokoll für den sequenziellen DNA-Verdau

1. Die Komponenten in der angegebenen Reihenfolge in ein sauberes Röhrchen geben:
        1 µl DNA (Konzentration 1 µg/µl)
   2 µl 10x-Puffer
   1 µl Restriktionsenzym
   16 µl steriles Wasser
   
2. Die Reaktion eine Stunde bei Verdautemperatur (üblicherweise 37 °C) inkubieren.
3. Den Verdau durch Wärme-Inaktivierung (65 °C über 15 Minuten) oder Zugabe von 10 mM EDTA-Endkonzentration beenden.
4. Wiederherstellen der DNA mit einem Aufreinigungskit: Die DNA resuspendieren und auf 1 µg/µl verdünnen.
5. Einen zweiten Verdau gemäß Schritt 1 vorbereiten. Mit Schritt 3 fortfahren.
6. Die verdaute DNA kann für Forschungszwecke verwendet werden.