Průvodce tkáňovou disociací: Typy enzymů kolagenáza, dispáza a liberáza

Všeobecné informace o našich enzymech pro disociaci tkání

• Popis našich enzymů kolagenázy
• Produkty enzymů kolagenázy
• Kollagenáza a Liberáza^® Enzymy od společnosti Roche
• Kollagenázové testy
• Řešení problémů a reference k tkáňové digesci/disociaci kolagenázy

Kolagenázy jsou enzymy, které rozkládají nativní kolagen, který drží živočišné tkáně pohromadě, a jsou vytvářeny různými mikroorganismy a mnoha různými živočišnými buňkami¹. Nejsilnější kolagenázou je "surová" kolagenáza vylučovaná anaerobními bakteriemi Clostridium histolyticum. Původně jsme převzali postup fermentace a purifikace z roku 1953, který popsali MacLennan, Mandl a Howes², ale nakonec jsme jej vylepšili pro produkty s vyšší aktivitou. "Surová" kolagenáza odkazuje na skutečnost, že materiál je směsí několika různých enzymů kromě kolagenázy, které společně působí na rozklad tkáně. Nyní je známo, že jsou přítomny dvě formy enzymu kolagenázy^3,4. Až na několik výjimek jsou různé komerční kolagenázy všechny vyrobeny z C. histolyticum nebo se jedná o rekombinantní verze, kdy Escherichia coli exprimuje gen klonovaný z C. histolyticum.

Popis našich kolagenázových enzymů

Různé kolagenázové produkty v níže uvedených tabulkách byly vyvinuty proto, že každý z nich tráví některé typy tkání (sval, slinivka, srdce, tuk) lépe než jiné. Kromě splnění specifikací enzymové aktivity musí každá šarže našich kolagenázových produktů projít testy trávení s různými tkáněmi potkanů. Výrobky, které jsou také označeny jako "testované na buněčných kulturách", prošly dalšími testy s buněčnými liniemi savců, aby se ověřilo, že nejsou cytotoxické.

Sterilně filtrované (0.2 mm) připravené z některých oblíbenějších kolagenázových produktů jsou rovněž uvedeny níže.

Naše purifikované kolagenázové produkty mají pouze stopové množství kaseinázové (proteolytické) nebo klostripainové aktivity. Purifikovaná kolagenáza typu VII je nabízena také ve verzi testované na buněčných kulturách a ve verzi se sterilní filtrací.

Kollagenázové enzymové produkty - surová kolagenáza, chromatograficky čištěná, kolagenáza s inhibitorem proteolytické aktivity a směsi

Surová kolagenáza pro všeobecné použití

a, b FALGPA a kolagenázové trávicí jednotky (CDU), obojí udáváno v jednotkách na mg/pevné látky.

Produkt	Komentáře	FALGPAa	CDUs.b
C0130	Pro všeobecné použití	0.25 - 1.0	> 125
C1639, typ I-S	Sterilní filtrovaná verze C0130	0.25 - 1.0	> 125
C9891, typ IA	Druhá verze typu I pro všeobecné použití	0.5 - 2.0	> 125
C2674, typ IA	Verze C9891 testovaná na buněčných kulturách	0.5 - 2.0	> 125
C5894, typ IA-S	Sterilní filtrovaná verze C9891	0.5 - 2.0	> 125
.C9722, typ IA-S	Buněčnou kulturou testovaná a sterilně filtrovaná verze C9891	0.5 - 2,0	> 125

Surová kolagenáza, testováno na použití

a, b FALGPA a kolagenázové trávicí jednotky (CDU), obojí udáváno v jednotkách na mg/pevné látky.

Produkt	Komentáře	FALGPA a	CDUs b
C6885, typ II	Testováno jako vhodné pro trávení a uvolňování tukových (adipózních) buněk s nepoškozenými receptory na povrchu buněk pro inzulin5,6	0.5 - 2.0	> 125
C1764, typ II-S	Sterilní filtrovaná verze C6885	0.5 - 2.0	> 125
C5138, typ IV	Testováno jako vhodné pro rozklad a uvolnění životaschopných jaterních buněk potkanů (hepatocytů)7	0.5 - 2.0	> 125
C1889, typ IV-S	Sterilní filtrovaná verze C5138	0.5 - 2.0	> 125
C2139, typ VIII	Prošel testem na tukovou tkáň (viz C6885)5, 6 a testem na jaterní tkáň (viz C5138)7	0.5 - 2.0	> 125
C9263, typ V	Testováno jako vhodné pro trávení a uvolňování Langerhansových ostrůvků (buněk produkujících inzulín) z krysího pankreatu8,9	1.0 - 3.0	> 125
C2014, typ V-S	Sterilní filtrovaná verze C9263	1.0 - 3.0	> 125
C7657, typ XI	Má nejvyšší kolagenázovou aktivitu - testováno jako vhodné pro trávení a uvolňování Langerhansových ostrůvků (buněk produkujících inzulín) z krysí slinivky8,9	2.0 - 5.0	> 1,200
C9407, typ XI	Verze C7657 testovaná na buněčných kulturách	2.0 - 5.0	> 1,200
C4785, typ XI-S	Sterilní filtrovaná verze C7657	2.0 - 5.0	> 1 200
C9697, typ XI-S	Buněčnou kulturou testovaná a sterilně filtrovaná verze C7657	2.0 - 5,0	> 1 200

Chromatograficky přečištěná kolagenáza

a, b FALGPA a kolagenázové trávicí jednotky (CDU), obojí udáváno v jednotkách na mg/pevné látky.

Produkt	Komentáře	FALGPAa	CDUb
C0255, typ III	Purifikovaná kolagenáza, která má stopové množství proteázové aktivity	4 - 12	≥ 250
C0773, typ VII	Purifikovaná kolagenáza v podstatě bez proteázy a klostripainu	4 - 12	1,000 - 3,000
C2799, typ VII	Verze C0773 testovaná na buněčných kulturách	4 - 12	1 000 - 3 000
C2399, typ VII-S	Sterilní filtrovaná verze C0773	4 - 12	1,000 - 3,000
C9572, typ VII-S	Buněčnou kulturou testovaná a sterilně filtrovaná verze C0773	4 - 12	1,000 - 3,000

Surová kolagenáza s inhibitorem proteolytické aktivity

a, b FALGPA a kolagenázové trávicí jednotky (CDU), obojí udáváno v jednotkách na mg/pevné látky.

Produkt	Komentáře	FALGPA a	CDUs b
C6079, typ S	Směs kolagenázy typu XI s inhibitorem tryptické proteázy. Testováno jako vhodné pro štěpení a uvolňování Langerhansových ostrůvků (buněk produkujících inzulín) z krysího pankreatu8, 9	2 - 5	Minimálně 1 000

Směsi kolagenáz™

Tyto produkty byly vyvinuty s cílem umožnit větší reprodukovatelnost jednotlivých šarží při trávení kolagenáz. Poměr purifikované kolagenázy (směs F) k purifikované klostridiové neutrální proteáze se ve směsích H a L mění, aby výzkumníkům poskytl řadu možností trávení.

a, c FALGPA a kolagenázové trávicí jednotky (CDU), obojí udáváno v jednotkách na mg/pevné látky.

Produkt	Komentáře	FALGPAa	Proteázac.
C7926, směs F	Převážně pravé kolagenázy. Protože aktivita FALGPA je vysoká ve srovnání s CDU, předpokládá se, že je přítomna převážně forma kolagenázy typu II	Min. 2.0	< 10
C8051, směs H	Nějaká neutrální proteázová aktivita zahrnutá s kolagenázovou aktivitou	Min. 1,0	Min. 10
C8176, Směs L	Více neutrální proteázová aktivita je obsažena u pravé kolagenázy	< 1.0	Min. 40

Enzymy kolagenázy a liberázy^® od společnosti Roche

Enzymy kolagenázy od společnosti Roche jsou intuitivně navrženy a důvěryhodně poskytují konzistentní výkon a reprodukovatelné výsledky pro vaše rutinní i kritické aplikace. Kolagenáza je vhodná pro přípravu buněk z mnoha typů tkání, jako jsou hepatocyty, adipocyty, pankreatické ostrůvky, epitelové buňky, svalové buňky a endotelové buňky. Vhodnost každé šarže enzymu pro rozrušení tkáně by však měla být stanovena empiricky. Naše enzymová technologie Liberase^® navíc kombinuje vysoce purifikované enzymy kolagenázy I a II s enzymy Dispase^® nebo Thermolysin, což usnadňuje disociaci široké škály typů tkání.

Příručka k aplikaci libraze pro výzkumné účely

*Údaje vycházejí z publikací

Typ tkáně	TL	TM	TH	DL	DH
Játra		+			+
Dřeň
+		++
Kůže				+	++
Srdce		+	+<		+
Slinivka (ostrůvky)	++			+
Lymfatické uzliny*	++	+
Slezina*	++
Plíce*	++	++	++
Tkáň vaječníků*<		++
Tkáň tukové tkáně*		++
Kornatina*		++

Dispázové enzymy

Společně s enzymy dostupnými od společnosti Roche se snažíme poskytovat vysoce purifikovaná a spolehlivá tkáňová disociační činidla pro vaše specifické aplikační potřeby. Dispáza je šetrný enzym, který nepoškozuje buněčné membrány a je vhodný k separaci různých tkání a buněk, které jsou pěstovány in vitro a k prevenci shlukování buněk u suspenzních kultur.

Kollagenázové testy

Formy purifikovaných enzymů kolagenázy typu I a typu II se liší svou specifitou a relativní aktivitou na nativním kolagenu a syntetických substrátech. Tyto dvě kolagenázy lze většinou rozlišit podle jejich preference pro jeden ze dvou různých substrátů použitých v našich testech. Test CDU (Collagenase Digestive Unit)^10,11 měří převážně aktivitu kolagenázy I, která štěpí dva ze tří šroubovicových řetězců v dlouhém nedenaturovaném kolagenovém proteinu. Aktivita kolagenázy II se měří podle schopnosti tohoto enzymu štěpit krátký syntetický peptid, N-[3-(2-(2-Furyl)akryloyl)]-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA, viz produkt č. 1). F5135), ve druhém testu na trávení kolagenázy^12,13. Ukázalo se, že purifikované přípravky kolagenázy I nebo II jsou méně účinné při trávení různých typů kolagenu nebo savčích tkání ve srovnání se směsí obou forem tohoto enzymu. Purifikovaná kolagenáza obsahující pouze formy kolagenázy I a II tohoto enzymu je méně účinná při trávení tkání než celá surová kolagenáza nebo kombinace purifikované kolagenázy a různých proteáz. Je zřejmé, že kombinace pravé kolagenázy a různých nativních proteáz, klostripainů a aminopeptidáz, které se vyvinuly v přírodě, si vzájemně pomáhají při trávení kolagenu v různých živočišných tkáních. Pro trávení tkání byly vždy nejúčinnější produkty surové kolagenázy. Někteří výzkumníci zkoušeli k trávení tkání směsi chromatograficky purifikované kolagenázy s proteázou, jako je trypsin nebo subtilizin.

Kromě testů CDU a FALGPA na kolagenázové aktivity testujeme každou šarži výrobku na kaseinázovou^14,15, klostripainovou a tryptickou aktivitu, abychom zjistili proteolytické enzymatické aktivity v kolagenázových produktech. Test kaseinázy je nejdůležitější z těchto tří testů pro měření proteolytické aktivity, která napomáhá trávení živočišných tkání. Protože klostripain přítomný v surové kolagenáze musí být redukován (např. ošetřením dithiotreitolem), aby byl aktivní, přispívá tento enzym pravděpodobně jen málo k procesu disociace tkáně v laboratoři. Je sledován, protože někteří výzkumníci uvádějí, že Clostripain může být škodlivý nebo toxický.

Mnoho produktů kolagenázy, které splňují enzymové specifikace, je také testováno na použití s různými tkáněmi získanými z potkanů. Typ II (C6885, C1764) a typ VIII (C2139) šarže kolagenázy jsou testovány na schopnost uvolňovat tukové (tukové) buňky z nadvarlatových tukových polštářků potkanů⁵. Tukové buňky jsou poté testovány na metabolickou aktivitu měřením rychlosti oxidace glukózy s přídavkem inzulínu a bez něj. Typ IV (C5138, C1889) a typ VIII (C5138) se při zkouškách v laboratoři zkoumají na základě výsledků, které jsou uvedeny v tabulce 2.a href="/CZ/cs/product/SIGMA/C2139">C2139) šarže byly testovány na schopnost uvolňovat životaschopné buňky z jater potkanů⁷. Typ V (C9263, C2014), typ XI (<.a href="/product/SIGMA/C7657">C7657, C4785, C9407 a C9697) a typ S (C6079) šarže kolagenázy musí uvolňovat neporušené Langerhansovy ostrůvky z krysí slinivky břišní, aby prošly testem výrobku⁸.

Řešení problémů a odkazy na kolagenázovou digesci/disociaci tkání

Na základě našeho vlastního výzkumu a vývoje a z diskusí se zákazníky je zřejmé, že způsob, jakým je konkrétní tkáň rozřezána a připravena, má významný vliv na rychlost a účinnost jakékoliv tkáňové digesce-disociace pomocí kolagenázy. Rozdíly ve stáří dárců tkáně mohou být také významným zdrojem rozdílů v čase. Ujistěte se, že jsou v rozkladných pufrech přítomny vápenaté ionty v koncentraci 5 mM. Chelační činidla EGTA a EDTA mohou vážně inhibovat aktivitu kolagenázy odstraněním vápenatých iontů potřebných pro stabilitu a aktivitu enzymu. β-merkaptoethanol¹⁶, cystein¹⁶ a 8-hydroxychinolin-5-sulfonát¹⁶ ;jsou další inhibiční látky. Nová šarže kolagenázy s vyšší specifickou aktivitou by mohla při stanovené koncentraci způsobit nadměrnou buněčnou smrt. V takovém případě použijte menší množství kolagenázy a/nebo přidejte BSA nebo sérum (do 0,5 %, resp. 5-10 %), abyste stabilizovali buňky k dalšímu trávení.

Problém	Příčina	Řešení	Reference
Špatné trávení<./td>	Neaktivní enzymy Nedostatečné množství Ca++ Nedostatečné množství enzymů	Skladujte kolagenázu v chladu a suchu. Roztok kolagenázy skladujte ve zmražených alikvotech. Do roztoku kolagenázy přidejte 5 mM Ca++  Použijte více kolagenázy. Vyzkoušejte naše směsi s vyšší proteázovou aktivitou.	6 7
Uvolněné buňky jsou zachyceny	DNA uvolněná z rozbitých buněk <.br> Nedostatečné nebílkovinné gumy	Snížit míchání Přidat DNAse** Tkáň před trávením dobře propláchnout*** Nepoužívat Mg++ v trávicím roztoku Přidejte hyaluronidázu s enzymy**	7 9 7 7
Buňky jsou usmrceny	Přebytek proteáz Změny pH Příliš málo kyslíku	Snížit působení proteáz* Přidat albumin nebo zahřáté sérum Použít pufry (např.HEPES) místo HCO-3. Často kontrolujte a upravujte pH Provzdušňujte roztok (vzduchem nebo O2) Digestujte rychleji použitím většího množství enzymů	7 19
Výtěžnost buněk je nízká	Rovnováha enzymů Adhezní faktory	Použijte více kolagenázy* Zahrňte elastázu s kolagenázou** Tkáň nejprve perfuzujte, abyste odstranili Ca++***	20 7
Mnoho buněk je poškozeno	Nadměrná proteáza Fyzikální poškození	Používejte méně proteázy* Přidejte albumin nebo zahřáté sérum S tkání a buňkami zacházejte velmi opatrně	21 7
Nová šarže nefunguje	Varianta šarže	Používejte frakcionované kolagenázové "směsi" (výrobek č. 1), které jsou určeny k výrobě kolagenázy. C7926, C8051 nebo C8176)*

* Samostatně připravené enzymy kolagenáza a proteáza v produktech "Blend" (č. C7926, C8051 nebo C8176) umožňují reprodukovatelnou kontrolu toho, kolik kterého přípravku se použije.

** DNAse bude inaktivována smykem při nadměrném míchání a přidané enzymy mohou být natráveny neutrální proteázou přítomnou v kolagenáze.

*** K odstranění Ca++ a odplavení mikroorganismů použijte EGTA (nebo EDTA), poté promyjte tkáň pufrem, abyste odstranili chelatační činidlo. Nepřidávejte EGTA nebo EDTA do roztoků enzymů!

Odkazy

1. Harper E. 1980. Collagenases. Annu. Rev. Biochem.. 49(1):1063-1078. https://doi.org/10.1146/annurev.bi.49.070180.005215

2. MacLennan JD, Mandl I, Howes EL. 1953. BACTERIAL DIGESTION OF COLLAGEN 1. J. Clin. Invest.. 32(12):1317-1322. https://doi.org/10.1172/jci102860

3. Bond MD, Van Wart HE. 1984. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23(13):3085-3091. https://doi.org/10.1021/bi00308a036

4. Matsushita O, Jung C, Katayama S, Minami J, Takahashi Y, Okabe A. 1999. Gene Duplication and Multiplicity of Collagenases in Clostridium histolyticum. J. Bacteriol.. 181(3):923-933. https://doi.org/10.1128/jb.181.3.923-933.1999

5. Rodbell M. 1964. Metabolism of Isolated Fat Cells. Journal of Biological Chemistry. 239(2):375-380. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)51687-2

6. Fain JN. 1975. [53] Isolation of free brown and white fat cells.555-561. https://doi.org/10.1016/0076-6879(75)35184-7

7. Seglen PO. 1976. Chapter 4 Preparation of Isolated Rat Liver Cells.29-83. https://doi.org/10.1016/s0091-679x(08)61797-5

8. Lacy PE, Kostianovsky M. 1967. Method for the Isolation of Intact Islets of Langerhans from the Rat Pancreas. Diabetes. 16(1):35-39. https://doi.org/10.2337/diab.16.1.35

9. Buitrago A, Gylfe E, Henriksson C, Pertoft H. 1977. Rapid isolation of pancreatic islets from collagenase digested pancreas by sedimentation through percoll? at unit gravity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 79(3):823-828. https://doi.org/10.1016/0006-291x(77)91185-8

10. Moore S, Stein WH. 1948. PHOTOMETRIC NINHYDRIN METHOD FOR USE IN THE CHROMATOGRAPHY OF AMINO ACIDS. Journal of Biological Chemistry. 176(1):367-388. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)51034-6

11. “Enzymatic Assay of Collagenase. Collagen Digestion Assay”, our quality control test procedure..

12. Van Wart HE, Steinbrink D. 1981. A continuous spectrophotometric assay for Clostridium histolyticum collagenase. Analytical Biochemistry. 113(2):356-365. https://doi.org/10.1016/0003-2697(81)90089-0

13. “Enzymatic Assay of Collagenase Using FALGPA as the Substrate”, our quality control test procedure..

14. Anson M, Gen. Physiol. J. The Estimitation of Pepsin, Trypsin, Papain and Cathepsin with Hemoglobin. 22, 79 (1938).

15. “Enzymatic Assay of Caseinase (Collagenase Products)”, our quality control test procedure..

16. Seifter S, Gallop PM, Klein L, Meilman E. 1959. Studies on Collagen. Journal of Biological Chemistry. 234(2):285-293. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)70290-1

17. Berry MN, Friend DS. 1969. HIGH-YIELD PREPARATION OF ISOLATED RAT LIVER PARENCHYMAL CELLS. 43(3):506-520. https://doi.org/10.1083/jcb.43.3.506

18. Bellemann P, Gebhardt R, Mecke D. 1977. An improved method for the isolation of hepatocytes from liver slices. Analytical Biochemistry. 81(2):408-415. https://doi.org/10.1016/0003-2697(77)90711-4

19. Ives HE, Schultz GS, Galardy RE, Jamieson JD. 1978. Preparation of functional smooth muscle cells from the rabbit aorta.. 148(5):1400-1413. https://doi.org/10.1084/jem.148.5.1400

20. Fain JN, Loken SC. 1969. Response of Trypsin-treated Brown and White Fat Cells to Hormones. Journal of Biological Chemistry. 244(13):3500-3506. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)83400-7

21. Berry, M, Edwards, Aa, Barritt, G. 1991. Isolated Hepatocytes; Preparation, Properties and Applications. Elsevier. .