Agua ultrapura para medios de cultivo sin BPA
Merina Corpinot, PhD1, Maurizio Zuccotti, PhD2, Daniel Darbouret, PhD1
1R&D Department, Lab Water Solutions, MilliporeSigma, Guyancourt, France, 2Laboratory of Developmental Biology, Department of Biology and Biotechnology “Lazzaro Spallanzani”, University of Pavia, Italy
El objetivo de este estudio era establecer una técnica que permitiera detectar bajos niveles del disruptor endocrino bisfenol A (BPA) en agua y, de manera más específica, documentar cómo un sistema de purificación de agua Milli-Q® IQ 7000 equipado con un ultrafiltro BioPak® (configuración recomendada para aplicaciones de biología molecular) produce agua ultrapura de referencia adecuada para la investigación embriológica sensible al BPA.
Más información sobre
- Problemas de salud provocados por disruptores endocrinos como el bisfenol A
- Estudio 1: HP-SPME-GC-MS para medir el BPA en agua ultrapura utilizada en investigación embriológica
- Estudio 2: Agua ultrapura sin BPA para análisis citológicos y moleculares destinados a evaluar el impacto del BPA en la maduración de los ovocitos
- Estudio 3: Agua ultrapura sin BPA para medios utilizados en la tecnología de obtención de imágenes celulares
- Conclusión: Agua ultrapura para aplicaciones sensibles al BPA en estudios de embriogénesis
- Materiales y métodos para el análisis del BPA mediante HP-SPME-GC-MS
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Problemas de salud provocados por disruptores endocrinos como el bisfenol A
Los disruptores endocrinos son sustancias químicas que interfieren en la función del sistema endocrino de los seres humanos y los animales. Afectan al crecimiento, así como a la reproducción, al sistema inmunitario y al nervioso, provocando consecuencias adversas para la salud. Encontrados en plásticos (incluidos los fungibles y equipos de laboratorio), lacas, resinas y tensioactivos, los disruptores endocrinos se consideran omnipresentes.
Las normas y directrices regulan las dosis máximas de disruptores endocrinos permitidas en productos alimenticios sólidos y líquidos, así como su presencia en el medio ambiente. Entre los diversos disruptores endocrinos producidos industrialmente, el BPA es uno de los más extendidos. El BPA se conoce como un “xenoestrógeno”, ya que imita a la hormona estrógeno y, por lo tanto, plantea importantes problemas de salud. Varios estudios han confirmado que el BPA interfiere en la producción de hormonas y la expresión de sus genes. Investigaciones recientes revelaron que concentraciones incluso bajas de BPA (20 µg/kg/día, que representa una dosis de BPA ambientalmente relevante durante 1 semana de exposición fetal) pueden afectar a la producción de ovocitos sanos (Figura 1), al interferir durante su crecimiento dentro del ovario.1-3
El objetivo de los estudios descritos a continuación era demostrar que la calidad del agua ultrapura (Tipo I) obtenida a partir de un sistema de purificación Milli-Q® es adecuada para preparar medios y disoluciones en las que se garantice la ausencia de BPA, de manera específica en un ambiente de cultivo carente de BPA para experimentos en biología reproductiva.
- En el estudio 1, se muestran los resultados del análisis de BPA en diferentes tipos de agua utilizando microextracción en fase sólida de alto rendimiento acoplada a cromatografía de gases y espectrometría de masas (HP-SPME-GC-MS).
- En el estudio 2, se presentan los resultados de los análisis citológicos y moleculares para evaluar el impacto del BPA en la maduración de los ovocitos.
- En el estudio 3, se muestra la importancia del agua para los medios de cultivo utilizados en las tecnologías de obtención de imágenes celulares.
Figura 1.Análisis inmunocitoquímico microscópico de un ovocito de ratón durante la metafase II (MII) de la meiosis utilizando anticuerpos contra las proteínas de los husos meióticos (rojo) y los centrosomas (verde). Los cromosomas se contratiñeron con DAPI (azul).
Estudio 1: HP-SPME-GC-MS para medir el BPA en agua ultrapura utilizada en investigación embriológica
En biología reproductiva, el agua es un reactivo clave utilizado para realizar análisis (por ejemplo, preparación de medios de cultivo).
Científicos de la Universidad de Pavía en Italia utilizaron un método HP-SPME-GC-MS reproducible para analizar el contenido de BPA en el agua ultrapura utilizada en su investigación embriológica. El agua ultrapura analizada se suministró a partir de un sistema de purificación de agua ultrapura Milli-Q® IQ 7000 alimentado por agua purificada Elix® producida por un sistema que emplea una combinación de tecnologías de purificación, como la ósmosis inversa avanzada (RO), la electrodesionización (EDI) Elix® y una lámpara UV bactericida similar a un sistema de purificación de agua Milli-Q® HX. El sistema de producción de agua ultrapura Milli-Q® IQ 7000 estaba equipado con un ultrafiltro BioPak® en el punto de uso (Figura 2). El filtro de ultrafiltración BioPak® se recomienda para suministrar agua que carezca de endotoxinas, nucleasas, proteasas y bacterias destinada a aplicaciones de biología molecular.
Figura 2.Resumen del análisis experimental del bisfenol A (BPA) en diferentes tipos de agua de laboratorio utilizando HP-SPME-GC-MS.
El análisis mediante HP-SPME-GC-MS demostró que el BPA no era detectable en el agua purificada Elix® ni en el agua ultrapura Milli-Q® utilizada para abastecer los experimentos de laboratorio, dentro de un límite de detección (LOD) de 4 nM (Tabla 1).
Como se mencionó, el agua experimental se dispensaba desde un ultrafiltro BioPak®. En la Figura 3 se muestra el resultado típico obtenido mediante el análisis de tres muestras de agua dispensadas consecutivamente desde un sistema Milli-Q® IQ 7000 equipado con un ultrafiltro BioPak® en el punto de uso. La repetibilidad y la robustez del análisis mediante GC-MS, así como las variaciones diarias en BPA, se evaluaron de acuerdo con los procedimientos descritos en la sección de materiales y métodos siguiente.
Los resultados demuestran que la calidad del agua ultrapura obtenida del sistema Milli-Q® IQ 7000 no contiene cantidades detectables de BPA (LOD = 4 nM). En particular, el análisis demostró que el BPA no lixiviaba desde el sistema hasta el agua producida, ya que no era detectable en el agua del grifo que abastecía al sistema de purificación de agua.
Figura 3.Cromatogramas en los que se indican los niveles de BPA en tres muestras de agua ultrapura. Las muestras se obtuvieron consecutivamente en el punto de uso de un sistema de producción de agua ultrapura Milli-Q® IQ 7000 equipado con un ultrafiltro BioPak®.
Los dos estudios siguientes revelan que un sistema de purificación de agua ultrapura Milli-Q® puede utilizarse con confianza para dispensar agua de alta calidad sin contaminación con BPA y puede emplearse luego en el estudio de los efectos de los disruptores endocrinos en el desarrollo de gametos y embriones, especialmente el agua extraída después del ultrafiltro BioPak®.
Estudio 2: Agua ultrapura sin BPA para análisis citológicos y moleculares destinados a evaluar el impacto del BPA en la maduración de los ovocitos
Cuando se mide el impacto de una molécula concreta, el entorno experimental debe carecer de la molécula de interés. En el estudio presentado, los científicos utilizaron qRT-PCR para analizar la expresión de la transcripción de cuatro genes de efecto materno, el Brg1 (remodelador de la cromatina), el Dnmt3a y el Dnmt3l (metilasas de ADN) y el Oct-4 (marcador de pluripotencia celular). Las muestras consistieron en tres grupos independientes de 10 ovocitos de ratón en metafase II (MII) obtenidos después de 15 horas de maduración in vitro (IVM) de ovocitos antrales totalmente crecidos en presencia de BPA 10 nM, 100 nM o 1000 nM.
Los resultados revelaron que el BPA no detenía la maduración meiótica a las tres dosis analizadas, ya que la gran mayoría (96,5 %) de los ovocitos alcanzaron el estadio MII, sin una diferencia significativa entre los controles (CTR) y las muestras expuestas. Sin embargo, se observó una alteración significativa de la expresión de todos los genes analizados (ya fuera mayor o menor que en el control no tratado) a todas las concentraciones de BPA analizadas, excepto en el Oct-4, que no se alteró a la concentración de BPA 10 nM (Figura 4).
Estos experimentos de expresión génica se realizaron utilizando agua ultrapura dispensada desde un sistema de purificación de agua Milli-Q® IQ 7000 equipado con un ultrafiltro BioPak®. Los resultados respaldan la idoneidad del agua ultrapura dispensada desde este sistema Milli-Q® para ser utilizada en aplicaciones sensibles al BPA en biología reproductiva.
Figura 4.Perfiles de expresión de los genes de efecto materno Brg1, , Dnmt3a, Dnmt3l y Oct-4 en ovocitos de ratón expuestos a 10, 100 o 1 000 nM BPA durante la transición GV a MII. Los valores de expresión de las muestras de control (CTR) se fijaron en 1 para el cálculo del cambio de n veces. Los valores se expresan como media ± SD. *p < 0,05 **p > 0,001.
Estudio 3: Agua ultrapura sin BPA para medios utilizados en la tecnología de obtención de imágenes celulares
La obtención de imágenes a intervalos nos permite observar los movimientos que ocurren dentro de un ovocito durante su transición de vesícula germinal (GV) a estadio MII del desarrollo (video4). Estos movimientos, conocidos como velocidad de movimiento citoplásmico (CMV), sirven como un marcador citológico no invasivo para evaluar la competencia de desarrollo de un gameto femenino (la calidad y la capacidad de un gameto para sostener un desarrollo ulterior).5,6 En el estudio que se indica, se ha utilizado esta nueva técnica para investigar la CMV que ocurre durante la transición de GV a MII de ovocitos madurados en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de BPA (en la Figura 5 se muestran datos representativos solo para el BPA 100 nM).
El análisis de la velocidad de imágenes de partículas celulares (PIV de la célula) demostró ventanas temporales de desarrollo específicas cuando los ovocitos eran sensibles a las dosis de BPA probadas. Sorprendentemente cuando se utilizó la concentración de baja de BPA, 10 nM, las alteraciones en la CMV se dispersaron en momentos únicos, mientras que a las dosis más elevadas, las alteraciones en la CMV fueron visibles durante un tiempo prolongado en la transición de GV a MI. En concreto, el BPA 100 nM produjo diferencias significativas dentro de un intervalotemporal cuando la cromatina se condensa y los centrómeros se agregan en grandes cromocentros para formar la placa meiótica (Figura 5).
Los medios de cultivo involucrados en los experimentos de CMV anteriores se prepararon con agua ultrapura suministrada por un sistema de purificación de agua Milli-Q® IQ 7000 equipado con un ultrafiltro BioPak®. Los resultados subrayan la necesidad de medios de cultivo exentos de BPA, ya que incluso dosis bajas de BPA, 100 nM, pueden tener efectos detectados ya sea a través del análisis de la expresión génica o de los movimientos citoplásmicos.
Figura 5.(A) Imágenes representativas de un ovocito en GV, tomadas en el marco 1 (a), y de un ovocito en MII en el marco 100 (b). Los recuadros muestran imágenes ampliadas con flechas (vectores de velocidad) que indican la intensidad y la dirección de los movimientos citoplásmicos. El color y la longitud de las flechas indican el módulo de velocidad de los movimientos en comparación con el marco anterior. Barra de escala vectorial coloreada (nm/min): el azul indica baja velocidad; el púrpura, alta velocidad. Barra: 10 μm. (B) perfil de movimiento citoplásmico durante la transición de GV a MII de ovocitos de ratón en ausencia (verde) o presencia (gris) de BPA 100 nM. *p < 0,05.
Conclusión: Agua ultrapura para aplicaciones sensibles al BPA en estudios de embriogénesis
La sensibilidad y el rendimiento crecientes de las técnicas de investigación requiere agua purificada de gran calidad para evitar la contaminación que puede afectar a la precisión y la autenticidad de los resultados experimentales. Especialmente en los estudios que involucran herramientas experimentales muy avanzadas, los científicos requieren agua de gran pureza para evitar cualquier problema que pueda alterar sus resultados (por ejemplo, BPA, endotoxinas, nucleasas, proteasas y bacterias) y para una mayor confianza en sus análisis experimentales.
En el campo de la embriología, se ha demostrado que incluso concentraciones bajas del disruptor endocrino BPA afectan a la investigación de la embriogénesis al interferir en el crecimiento de los ovocitos. Esto es preocupante porque el BPA, aunque no está necesariamente presente en un principio en el agua de suministro del grifo de un laboratorio, puede lixiviar de los fungibles y equipos de laboratorio, causando interferencias en los resultados experimentales.
En este artículo, aunque demostramos que concentraciones bajas de BPA no detuvieron la maduración meiótica, una concentración muy baja de BPA de solo 10 nM impactó tanto en la expresión génica como en los movimientos que ocurren dentro de un ovocito durante su transición de vesícula germinal (GV) a estadio de desarrollo MII. Estos resultados ponen de relieve la necesidad de realizar experimentos embriológicos en un entorno exento de BPA, incluido el uso de agua ultrapura de la que se garantice la ausencia de niveles detectables de BPA.
Se ha demostrado que el agua ultrapura suministrada por un sistema de purificación de agua ultrapura Milli-Q® IQ 7000 equipado con un ultrafiltro BioPak® no contiene BPA detectable, a un límite de detección incluso muy bajo de solo 4 nM según el método utilizado en este artículo. Por consiguiente, el agua ultrapura suministrada por este sistema se puede utilizar con confianza para estudiar los efectos de los disruptores endocrinos en el desarrollo de gametos y embriones.
Para encontrar soluciones de purificación de agua adaptadas a las necesidades de los análisis sensibles al BPA, solicite la asistencia de un experto en agua de laboratorio.
Materiales y métodos para el análisis del BPA mediante HP-SPME-GC-MS
Equipos
- Se utilizó un sistema de GC/MS de cuadrupolo simple DSQII Thermo Scientific (espectrómetro de masas TraceDSQII, cromatógrafo de gases TraceGCUltra) equipado con un muestreador automático CombiPAL (CTC Analytics, Suiza) para realizar el análisis del agua.
- Se utilizó una columna capilar Restek Rxi™ de 30 mm de longitud, 0,25 mm de diámetro interior, 0,25 µm de espesor de película (difenil al 5 % /dimetil polisilano al 95 %– Restek Corporation, Bellefonte, EE.UU.) con helio como gas portador a un caudal constante de 1,0 ml/min.
- Se utilizó un conjunto de fibra SPME de polidimetilsiloxano (PDMS) de 100 µm. La fibra se limpió antes de cada análisis durante 20 minutos en el calentador de aguja a 250 °C para evitar el arrastre del análisis anterior.
Preparación del patrón
Se preparó una disolución madre de BPA a una concentración de 10 nM en etanol al 100 %. Se realizó una serie de diluciones para obtener una curva de calibración con cuatro niveles de concentración diferentes, 1, 2, 4, 40 nmol/l utilizando agua HPLC.
Experimento 1: Evaluación de la repetibilidad y la robustez del análisis GC-MS
Se recogieron tres muestras de agua (5 ml) consecutivas de cada una de las tres fuentes: agua del grifo, agua purificada Elix® y agua del punto de uso de un sistema de agua ultrapura Milli-Q® IQ 7000 equipado con un ultrafiltro BioPak®. Antes de la recolección, se dispensaron 5 l de agua para enjuagar el sistema.
Experimento 2: Evaluación de las variaciones diarias en la concentración de BPA
Se recogieron tres muestras de agua (5 ml) del grifo, agua purificada Elix® y agua en el punto de uso de un sistema de agua ultrapura Milli-Q® IQ 7000 equipado con un ultrafiltro BioPak® cada 24 horas durante tres días. Antes de la recogida, se dispensaron 5 l de agua. Los cromatogramas están disponibles a demanda.
Muestra de agua
Se añadió un volumen de 5 ml de agua a analizar (denominado agua del grifo, agua purificada Elix® y agua ultrapura filtrada por BioPak®) en viales de vidrio de 20 ml. En cada vial, se añadieron 200 mg de KHCO3, 1 g de NaCl y una barra de agitación magnética desechable.
Derivatización
Se agregaron 30 µl de anhídrido acético a la muestra de agua y se sellaron los viales con una tapa de aluminio con espacio de cabeza y membrana de politetrafluoroetileno. Se obtuvo una reacción completa con un tiempo de reacción de derivatización de 5 min a 80 °C (con agitación continua a 50 rpm). La extracción de espacio de cabeza de BPA se realizó con la fibra PDMS de 100 µm a 80 °C durante 30 min con agitación (500 rpm). La fibra SPME se desadsorbió en el inyector a 250 °C durante 2 min
Análisis cromatográfico
La temperatura del horno se mantuvo a 150 °C durante 2 min, se aumentó en 30 °C/min hasta 280 °C y se mantuvo durante 6 min. La inyección se realizó en modo sin división de flujo; el tiempo sin división fue de 2 min y la temperatura del inyector PTV se mantuvo a 250 °C. La línea de transferencia se mantuvo a 290 °C y la fuente de iones a 250 °C. La MS se operó en el modo de ionización por impacto electrónico (EI) y los iones se registraron tanto en el modo de barrido completo, con un intervalo de masas de m/z 35-350 amu, como en el modo SIM (control seleccionado), utilizando el m/z 270 como cuantificador de iones para BPA.
Reconocimientos
Los autores agradecen al laboratorio de biología del desarrollo de la Universidad de Pavía (Italia) por llevar a cabo la presente investigación y a nuestros colegas de I+D por su contribución a este proyecto.
Referencias bibliográficas
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