Optimización para el análisis de alta resolución de los cannabinoides en diversas matrices utilizando la columna Ascentis® Express C18
Seamus Riordan-Short, Senior Chemist1, Yevgen Kovalenko, Technician1, Matthew Noestheden, Director of Operations1, Jennifer King, Program Marketing Manager2, Katherine K. Stenerson, Analytical Sciences Liaison2
1Supra Research and Development, 2MilliporeSigma
Al ir aumentado la legislación sobre el cannabis y el cáñamo, se ha producido un incremento de la demanda de desarrollo y validación de métodos precisos y exactos de ensayo para la cuantificación de su eficiencia. Los cannabinoides presentan una serie de desafíos. Además, existe la carga añadida de tener que tratar con una variedad de tipos de matrices. La HPLC/UV es la técnica utilizada con más frecuencia, y deben optimizarse los parámetros de la HPLC para mantener una buena separación y una retención estable durante muchas inyecciones y con los diversos tipos de muestra.
Los científicos de Supra Research and Development (“SupraRnD”), ubicado en Kelowna, Columbia Británica, Canadá (www.suprarnd.ca), han desarrollado un método de gran rendimiento fiable para los cannabinoides, que es aplicable a una gran gama de matrices. La participación de SupraRnd en los análisis del cannabis comenzó en 2015 cuando obtuvieron una licencia de Health Canada para analizar los productos del cannabis. En 2018 fue uno de los primeros laboratorios de Canadá en obtener su acreditación ISO 17025 para los análisis del cannabis. Su eficiente método ha evolucionado con el tiempo para satisfacer las cambiantes necesidades de sus clientes y ahora está validado para varias matrices diferentes.
Condiciones experimentales
Se congelaron muestras de flores completas en bolsas herméticamente cerradas a -80 °C durante un mínimo de 30 minutos, que se homogeneizaron luego inmediatamente.* Cuando se analiza la flor del cannabis es fundamental homogeneizar y submuestrear una muestra representativa, ya que puede haber una considerable variación en las concentraciones de fitocannabinoides entre plantas y dentro de una misma planta. El procedimiento de trabajo posterior consistió en una extracción simple con metanol de una muestra de 0,2 g de tamaño, seguida de ultrasonidos y la estabilización del extracto a -20 °C durante 1 hora. A continuación se centrifugó la muestra, y el sobrenadante se diluyó 100:1 para el análisis mediante HPLC. El pequeño tamaño de la muestra en combinación con la dilución previa al análisis minimiza la posibilidad de aparición de problemas relacionados con la matriz (por ejemplo, interferencias, longevidad de la columna, etc.). La parte correspondiente a la HPLC del análisis tiene un tiempo de ciclo de 8 minutos de una inyección a otra. Esto permite 60 inyecciones por intervalo de 8 horas, lo que conlleva el procesamiento de un mayor número de muestras por cliente en un turno de trabajo. En la Tabla 1 se indican los cannabinoides analizados por este método.
Análisis mediante HPLC de los cannabinoides
En la Tabla 2 se resumen los parámetros optimizados finales para HPLC.
Al desarrollar este método, se tuvieron en cuenta las siguientes consideraciones:
- La resolución cromatográfica de los 17 compuestos.
- Que un tiempo de ciclo (es decir, tiempo de ejecución más equilibrado) fuera inferior a 10 minutos en total.
- Un método resistente con un rendimiento uniforme para
- >1000 inyecciones con tiempos de retención estables, manteniendo a la vez una buena forma y respuesta del pico.
- Que fuera adecuado para utilizar con diferentes matrices como flor, chocolate, pomadas, aceite, concentrado, etc.
Calibración del método
La calibración para el método fue de 0,01 µg/ml a 40 µg/ml. En el caso de algunas muestras, esto requirió una gran dilución para situarlas dentro de este intervalo analítico. Para la calibración y el enriquecimiento, se utilizaron materiales de referencia certificados (CRM) Cerilliant®. Se diluyeron los CRM de cada cannabinoide a 1 mg/ml (excepto CBLA, que se diluyó a 0,5 mg/ml), junto con la disolución patrón interna, directamente en el componente A de la fase móvil de la HPLC, para preparar una disolución madre de 17 componentes a 40 µg/ml. Esta disolución se diluyó de nuevo en una mezcla 30:70 de fases móviles A:B de HPLC para los patrones de calibración de menor concentración.
Columna de HPLC: Ascentis® Express C18
La columna de HPLC utilizada para el análisis fue una columna Ascentis® Express C18, 15 cm x 2,1 mm de D.I., 2 µm. Las columnas Ascentis® Express contienen partículas Fused-Core® con un núcleo sólido y una arquitectura de capa porosa, también conocida como superficie porosa. Esta estructura de partícula proporciona una mayor eficiencia de separación que las partículas completamente porosas del mismo tamaño y permite tiempos de análisis más rápidos con menor sobrepresión que los métodos en los que se utilizan partículas completamente porosas más pequeñas (< 2 µm). La arquitectura de partículas de las columnas Ascentis® Express permite el uso de partículas más grandes, lo que las hace adecuadas para sistemas convencionales y para UHPLC. Para este método, SupraRnD utilizó un sistema de UHPLC aunque, con la optimización adecuada del instrumento, también puede obtenerse una separación satisfactoria en los sistemas convencionales. De manera específica esto implicaría la minimización de la dispersión del sistema. Esto puede conseguirse reduciendo la longitud del tubo y el diámetro interior de la entrada y salida de la columna; y para los detectores de UV, utilizando una celda de flujo con un volumen < 5 µl.
Validación y rendimiento del método
Antes de elegir la columna Ascentis® Express C18 para la validación del método, SupraRnD analizó otras seis columnas de química similar de varios fabricantes. Consiguieron resolución cromatográfica y un tiempo de ejecución corto con varias columnas, pero observaron que la Ascentis® Express C18 era la única columna que proporcionaba estabilidad en el tiempo de retención, en especial para los cannabinoides ácidos. Esto se ilustra en la Figura 1, que muestra la comparación de cromatogramas de un patrón en la inyección nº 1 y la inyección nº 1140, entre medias de las cuales se procesaron numerosos extractos de muestra.
Figura 1.Patrón de cannabinoide en la columna Ascentis® Express C18; comparación entre la inyección #1 y la inyección #1140.
El método en el que se utilizaba la columna Ascentis® Express C18 se validó en diferentes matrices, como flores de lúpulo (como matriz sustituta del cannabis), aceite de semillas de cáñamo, concentrado de CBD y pomadas de administración tópica. Las recuperaciones del lúpulo oscilaron entre el 85 y el 115 % en un intervalo de enriquecimiento del 0,05 y el 20 % en peso. En la Tabla 3 se resume esta validación, así como la de las demás matrices. Los límites máximos de residuos (MRL) alcanzados para los cannabinoides (excepto CBDV, CBG, CBD y CBC en el concentrado) fueron todos del 0,05 %peso. La repetibilidad, como desviación típica relativa (%RSD), fue < 4 % para todas las matrices. Se realizó una nueva evaluación utilizando ensayos de rendimiento en los que el método funcionó con éxito para muestras de flor del cannabis y aceite de cáñamo.
*Ni se cuantifica la recuperación de CBD debido a los elevados niveles incurridos
**No se cuantificada la recuperación de Δ9-THC debido a los elevados niveles incurridos
ŦCBDV, CBG, CBD, CBC soportados en matriz condujeron a problemas que impidieron el cálculo de los LMR para estos compuestos
En la Figura 2 se muestran ejemplos de cromatogramas de flores de lúpulo enriquecidas al 1 % peso/peso y a la concentración MRL del 0,05 % peso/peso. A una concentración de enriquecimiento mucho más bajo, donde la interferencia de la matriz era más evidente, los 17 cannabinoides eran discernibles de los picos de fondo y pudieron analizarse. Las interferencias específicas que eluían junto a THCV y CBL se debían probablemente a terpenos específicos presentes en la muestra de lúpulo. Estos picos no se observaron en la flor del cannabis. En una muestra de pomada enriquecida (Figura 3), se detectaron claramente todos los cannabinoides en los MRL.
Figura 2.Flores de lúpulo, enriquecidas un 1% con cannabinoides.
Flores de lúpulo, enriquecidas un 0,05 % con cannabinoides.
Figura 3.Pomada compuesta por extracto de cannabis, enriquecida al 0,05 % por peso.
Hasta la fecha, se han realizado más de 1 550 inyecciones en una sola columna Ascentis® Express C18. En SupraRnD se ha observado que hasta ahora no ha habido un aumento significativo en la sobrepresión de la columna ni una degradación del rendimiento. Los datos recopilados sobre la sobrepresión durante este uso mostraron un aumento neto del 2 %. También se observó que los tiempos de retención eran estables, lo que les permitió identificar con mayor confianza los picos de los cannabinoides en las muestras. En la Figura 4 se ilustra un ejemplo en el que se comparan dos matrices diferentes, el chocolate negro y la flor del cannabis. Ambas muestras contenían cantidades medibles de Δ9-THC, y la diferencia en el tiempo de retención entre las dos matrices era mínima.
Figura 4.Comparación del patrón de elución entre muestras de chocolate negro y de flores de cannabis (no enriquecidas).
Conclusión
Después de evaluar varias columnas de HPLC, SupraRnD ha desarrollado con éxito un método robusto y resistente utilizando la columna Ascentis® Express C18 para el análisis de 17 cannabinoides en diversas matrices. Hasta la fecha, el método se ha aplicado con éxito a cinco tipos de muestras diferentes: flores, pomadas, chocolate, concentrados y gominolas. La columna Ascentis® Express C18 se eligió para el método final por la estabilidad del tiempo de retención durante el uso repetido y la capacidad de mantener el rendimiento cromatográfico de los cannabinoides. Además, la columna actualmente en uso ha demostrado un aumento mínimo de la sobrepresión a lo largo de > 1 500 inyecciones.
* Después de la publicación de estos datos, SupraRnD retiró la etapa de congelación y homogeneizó las flores enteras a temperatura ambiente. Esto se hizo para reducir la posibilidad de aumentar el contenido de humedad mediante la condensación del agua atmosférica en las muestras frías.
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