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Marquage et détection d'acides nucléiques

Méthodes et protocoles de marquage et de détection de l'ADN et de l'ARN

Il existe un très large éventail de méthodes de marquage et de détection des acides nucléiques, des produits de PCR et des oligonucléotides. Le choix des réactifs et des méthodes couramment utilisés pour marquer et détecter les acides nucléiques dépend de plusieurs facteurs, dont le type de molécule à marquer et l'application en aval. Des méthodes enzymatiques ou chimiques permettent de marquer les acides nucléiques et d'y incorporer diverses molécules, comme des fluorophores, des enzymes ou des éléments radioactifs.

Marquage d'acides nucléiques et de sondes

Les acides nucléiques peuvent être marqués sur l'ensemble de la molécule ou au niveau des extrémités 5' et 3'. Les sondes d'acide nucléique sont particulièrement utiles dans les tests d'hybridation, par exemple pour détecter l'ARN en northern blot ou l'ADN en Southern blot. Différentes méthodes de marquage sont employées pour répartir le marqueur sur l'ensemble de la sonde, notamment la PCR avec désoxynucléotides-triphosphates (dNTP) ou nucléotides-triphosphates (NTP) marqués, l'amorçage aléatoire et la translation de coupure ou "nick translation". Le marquage au niveau des extrémités est particulièrement utile pour l'étude des interactions entre protéines et acides nucléiques, car il évite l'encombrement stérique.

Tests de marquage et de détection d'acides nucléiques

Selon la méthode de marquage choisie, on utilisera souvent une détection colorimétrique pour les sondes marquées enzymatiquement et l'autoradiographie pour les sondes radioactives. Les sondes marquées à la digoxigénine (DIG) et à la fluorescéine figurent parmi les sondes communément employées ; leur utilisation conjointe facilite la détection des sondes multicolores lorsqu'elle est couplée à des réactions colorimétriques (p. ex. phosphatase alcaline). L'incorporation de biotine-16-dUTP au cours de la PCR est également possible avec la plupart des ADN polymérases, comme méthode de marquage et de détection supplémentaire. L'hybridation in situ en fluorescence (FISH pour "Fluorescent In Situ Hybridization") utilise des sondes fluorescentes pour détecter les séquences d'ADN ; la réussite de la détection et de l'analyse dépend en partie de la sensibilité et de la résolution du microscope à fluorescence dont dispose le chercheur.

Applications des ADN et ARN marqués

Le transfert de macromolécules sur supports solides (membranes) est connu sous le nom de blotting. En raison de la spécificité des sondes marquées, l'hybridation de l'acide nucléique et de la sonde permet aux chercheurs de détecter aussi bien les séquences d'ADN que les séquences d'ARN dans les mélanges d'acides nucléiques complexes. De plus, le transfert sur membranes permet de recueillir de précieuses informations complémentaires, comme l'analyse de l'expression des gènes, la taille de l'ARNm et le nombre de copies, selon la technique utilisée. L'hybridation in situ fait également partie des méthodes couramment employées par les chercheurs pour détecter une ou plusieurs sondes marquées différemment (par exemple, des sondes marquées à la DIG et à la fluorescéine).

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