Préparation de banques NGS

Kits d'extraction d'ADN génomique

La préparation de banques d'ADN nécessite l'extraction de l'ADN génomique (ADNg) de haut poids moléculaire contenu dans des cellules, des tissus ou d'autres types d'échantillons. L'ADN génomique purifié doit présenter un cisaillement minime et le moins de contaminants biologiques et chimiques possible pour donner des résultats optimaux lors des réactions d'amplification ou de séquençage ultérieures.  

Le kit d'extraction d'ADN de haut poids moléculaire Fire Monkey™/Fire Flower™ permet d'isoler un ADN génomique ultrapur présentant un cisaillement minime et une faible teneur en acides nucléiques de bas poids moléculaire contaminants.

• Fire Monkey™ est un procédé d'extraction sur colonne de centrifugation standard qui permet d'extraire l'ADN de haut poids moléculaire (longueur moyenne des brins > 100 kilobases [kb]) contenu dans des bactéries ou des cellules de mammifères en 1 heure.
• Fire Flower™ est un procédé sur colonne de centrifugation standard qui permet de séparer, par exclusion stérique, l'ADN extrait de n'importe quel type d'échantillon en 15 minutes. Le procédé Fire Flower™ permet d'augmenter de 30 % la longueur moyenne des brins d'ADN, tout en éliminant les fragments de moins de 30 kb. 

Kits d'amplification de génome entier

L'analyse des séquences d'ADN est souvent limitée par la faible quantité d'échantillon disponible ou le faible rendement d'extraction. Lorsque le matériel de départ est disponible en quantité limitée, il est possible d'utiliser des techniques d'amplification pour augmenter la quantité d'ADN de départ. Une amplification du génome entier (WGA pour "Whole Genome Amplification") peut être utilisée pour préamplifier des échantillons d'ADN intact ou d'ADN hautement fragmenté, en vue de leur utilisation dans des procédures de séquençage de nouvelle génération.

Le kit SeqPlex-I WGA permet d'amplifier de petites quantités d'ADN ou des ADN dégradés ou hautement fragmentés, les produits amplifiés pouvant être chargés directement sur des supports solides ("flowcells") pour séquençage de nouvelle génération selon la technologie Illumina®.  

• Séquençage facilité dès 100 pg d'ADN
• Amorces améliorées couvrant l'ensemble du génome, limitant les biais de séquences et donnant des amplicons de taille idéale pour le séquençage de nouvelle génération
• Coût raisonnable : pas d'étape supplémentaire pour la préparation des banques NGS
• Compatibilité avec le séquençage de nouvelle génération Illumina^®

Le kit d'amplification d'ADN SeqPlex Enhanced pour amplification du génome entier est conçu pour faciliter le séquençage de nouvelle génération à partir de quantités d'ADN extrêmement réduites ou d'ADN dégradés ou hautement fragmentés. Ce kit a été mis au point pour s'intégrer dans les procédures de séquençage Illumina^®, SOLiD™ et 454.

• Amplification d'ADN fragmentés (immunoprécipitation de la chromatine ou échantillons fixés au formol et inclus en paraffine, par exemple) grâce à l'amorçage aléatoire
• Séquençage facilité dès 100 pg d'ADN (après immunoprécipitation de la chromatine)
• Amorces améliorées couvrant l'ensemble du génome, limitant les biais de séquences et facilitant leur propre élimination
• Kit compatible avec la préparation de banques pour le séquençage de nouvelle génération Illumina^®, SOLiD™ ou 454

Kits d'amplification de transcriptome entier

Le principal objectif de la préparation d'une banque NGS pour le séquençage du transcriptome (technique RNA-Seq) est de maximiser la complexité de la banque transcriptomique afin de représenter exactement le pool de séquences de départ, tout en limitant les biais. L'utilisation de la technique RNA-Seq pour le profilage de l'expression génique et l'analyse du transcriptome à haut débit se heurte souvent à la faible quantité d'ARN de départ disponible. La technique d'amplification du transcriptome entier (WTA) permet de produire suffisamment de cibles de séquençage à partir de faibles quantités d'ARN. Elle nécessite cependant une réplication très fidèle des transcrits, sans perte ni distorsion de certains ARNm, pour limiter les biais liés à la banque.

Le kit SeqPlex-I WTA permet l'amplification de petites quantités d'ARN rétrotranscrit ou d'ARN dégradés, les produits amplifiés pouvant être chargés directement sur des supports solides ("flowcells") pour séquençage de nouvelle génération selon la technologie Illumina®. 

• Amplification d'ARN totaux en quantités extrêmement réduites ou fragmentés Amplification aisée d'ARN intacts ou fragmentés de toutes origines (échantillons fixés au formol et inclus en paraffine, immunoprécipitation de l'ARN…) grâce à l'amorçage aléatoire
• Couverture transcriptomique plus complète et efficacité de l'amorçage grâce à la nature semi-dégénérée des amorces utilisées pour la constitution des banques
• Réduction du nombre d'étapes : inutile de fragmenter l'ADNc avant le séquençage
• Haute efficacité : amplification de l'ADNc double brin en 8 heures maximum
• Coût raisonnable : suppression de l'étape de préparation des banques NGS
• Compatibilité avec la technologie de séquençage de nouvelle génération Illumina^®

Le kit SeqPlex RNA Amplification pour amplification du transcriptome entier est conçu pour faciliter le séquençage de nouvelle génération à partir d'ARN ou d'ARN disponibles en faibles quantités, dégradés ou hautement fragmentés (p. ex. ARN d'échantillons de tissus fixés au formol et inclus en paraffine). Ce kit SeqPlex permet de préamplifier les échantillons d'ARN en vue de leur utilisation dans des procédures de séquençage de nouvelle génération.

• Amplification de faibles quantités d'ARN fragmentés ou intacts de toutes origines (échantillons fixés au formol et inclus en paraffine et immunoprécipitation de l'ARN, notamment) grâce à l'amorçage aléatoire
• Couverture transcriptomique plus complète et efficacité de l'amorçage grâce à la nature semi-dégénérée des amorces utilisées pour la constitution des banques
• Gain de temps : inutile de fragmenter l'ADN avant le séquençage
• Amplification de l'ADNc double brin en 8 heures maximum
• Kit compatible avec toutes les plateformes de séquençage de nouvelle génération, hormis celle de Pacific Bioscience

Préparation de banques de petits ARN

Les nouvelles techniques de séquençage (NGS) ont révolutionné l'étude des petits ARN, notamment les micro-ARN (miARN ou microRNA), les petits ARN interférents (pARNi ou siRNA) et les petits ARN interagissant avec les protéines PIWI (piARN ou piRNA), que l'on sait désormais jouer un rôle clé dans la régulation post-traductionnelle de l'expression génique. Le séquençage des petits ARN est une approche de plus en plus prisée dans la découverte et le profilage des petits ARN. Or, les méthodes de préparation de banques de petits ARN peuvent introduire des biais importants, en particulier lors des étapes de ligature des adaptateurs. 

Le kit de préparation de banques d'ARN RealSeq^®-AC propose une nouvelle méthode de préparation de banques de micro-ARN et de petits ARN à séquencer qui limite les biais liés à l'incorporation dans le séquençage de nouvelle génération. Grâce à un nouvel adaptateur unique et à l'emploi de la circularisation, ce kit RealSeq^® réduit fortement les biais lors de la préparation des banques. Cette technologie résout le problème lié aux préparations de banques de séquençage courantes, à savoir la sous-détection de nombreux micro-ARN.

• Réduction significative des biais lors du séquençage des petits ARN
• Quantification précise des petits ARN présentant un intérêt en biologie
• Amélioration de l'efficacité de découverte de nouveaux petits ARN

Purification des banques

La purification des banques NGS consiste à éliminer les adaptateurs de séquençage, les amorces de PCR, les désoxynucléoside-triphosphates (dNTP), les enzymes et les contaminants des tampons, tout en permettant la sélection des acides nucléiques qui se trouvent dans la bonne plage de tailles en vue de leur séquençage ultérieur. Les méthodes de purification de banques doivent maximiser le rendement et la quantité récupérée, minimiser la présence de contaminants biologiques et chimiques, et éliminer les molécules des banques ou les fragments d'acides nucléiques indésirables pour la préparation du séquençage.

Le système de purification de produits de PCR HighPrep™ est un réactif de purification post-PCR à base de billes paramagnétiques conçu pour purifier les fragments d'ADN et sélectionner les amplicons d'après leur taille. La purification consiste à éliminer les sels, les amorces, les dimères d'amorces et les dNTP pendant que les fragments d'ADN se lient sélectivement aux billes magnétiques. Les billes magnétiques sont utilisées avec différentes méthodes de préparation de banques pour le séquençage de nouvelle génération.

• Forte récupération d'amplicons de plus de 100 paires de bases (pb)
• Convient aux systèmes de manipulation de liquides à haut débit
• Récupération stable d'amplicons de plus de 100 pb, sélection par exclusion stérique prévisible et reproductible
• Rendement et pureté améliorés grâce à l'absence de centrifugation ou de filtration