Technique de pull-down (interactions protéines/protéines)
La technique de pull-down est conçue pour déterminer les interactions entre deux protéines ou plus. Avec les tests d'affinité par pull-down, une protéine "appât" est marquée et fixée à un ligand immobilisé (billes de support) par liaison covalente ou par l'intermédiaire d'une étiquette d'affinité, comme en chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC). Les principales étiquettes de fusion des protéines appâts comprennent la glutathion-S-transférase (GST) et les protéines à étiquette histidine. La protéine appât forme un complexe qui est ensuite incubé avec une source de protéines telle qu'un lysat cellulaire ou tissulaire. Les protéines d'intérêt sont éluées du support de billes par une série de lavages, et recueillies par centrifugation. La méthode de purification et de détection du pull-down est différente de celle de l'immunoprécipitation (IP) et de la co-immunoprécipitation (co-IP) en ce sens qu'il ne s'agit pas d'interactions anticorps/antigène. Avec tous les tests de pull-down, l'échantillon purifié est souvent analysé par électrophorèse SDS-PAGE, spectrométrie de masse et western blotting en vue d'analyses ultérieures.
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Applications de la technique de GST pull-down
La glutathion S-transférase (GST) est une protéine de 211 acides aminés qui est présente dans la plupart des organismes. La GST est souvent intégrée dans les vecteurs d'expression pour former l'étiquette de fusion dans les systèmes d'expression protéique de type E. coli. L'étiquette GST est une étiquette protéique de grande taille (environ 26 kDa) qui peut être exprimée par les bactéries, les levures et les cellules de mammifères et d'insectes. L'étiquette GST se révèle avantageuse lorsqu'il est nécessaire de protéger la protéine recombinante d'un clivage par les protéases intracellulaires ou lorsqu'il est nécessaire d'améliorer la solubilité de la protéine étiquetée. Enfin, la protéine GST constitue une étiquette de haute affinité qui facilite le processus de purification et qui permet de réaliser des expériences de pull-down sur des résines d'affinité peu coûteuses et dans des conditions d'élution douces.
Co-immunoprécipitation
La technique de pull-down est la solution idéale pour confirmer les résultats d'une co-immunoprécipitation ; c'est aussi un excellent moyen d'identifier les interactions inconnues entre protéines ainsi que l'état d'activation de certaines protéines. Contrairement aux tests d'affinité par pull-down, les tests d'immunoprécipitation utilisent des anticorps pour se lier aux antigènes et les isoler dans des échantillons biologiques complexes.
La co-immunoprécipitation désigne l'utilisation d'un anticorps pour fixer un antigène au sein d'un complexe multiprotéique. Ce complexe est ensuite capturé par l'ajout d'un support de protéine A ou de protéine G. La haute affinité de la protéine A ou G pour la région Fc des anticorps polyclonaux et monoclonaux de type IgG en fait un constituant clé pour la purification de la protéine ou du complexe protéique d'intérêt. Les méthodes de pull-down sont un outil essentiel pour l'étude des réseaux d'interactions protéines/protéines, bien que le choix de la méthode adaptée dépende des besoins de chaque application.
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