Lyse et extraction des protéines

Il existe une multitude de techniques pour lyser les cellules et préparer leur contenu pour l'analyse. Des techniques douces sont généralement utilisées lorsque l'échantillon est constitué de cellules sanguines ou de cellules en culture faciles à lyser. À l'inverse, des méthodes plus vigoureuses sont employées pour rompre les cellules plus coriaces comme les cellules bactériennes ou végétales, ou encore les cellules de mammifères incluses dans du tissu conjonctif.

• Lyse par détergents : Lyse par détergents : La lyse par détergents est une méthode douce qui peut être utilisée sur les cellules de mammifères, les cellules bactériennes, les levures et les plantes. Les suspensions cellulaires sont centrifugées à basse vitesse et remises en suspension dans une solution de lyse contenant des détergents dont l'action rompt la membrane cellulaire. Les membranes sont solubilisées, causant la lyse des cellules et la libération de leur contenu. Il peut être nécessaire d'éliminer les détergents en aval s'ils perturbent l'analyse ou la production.
• Lyse par congélation/décongélation : Cette technique peut être utilisée sur des suspensions de cellules de mammifères ou de cellules bactériennes. La suspension cellulaire est congelée rapidement dans de l'azote liquide. L'échantillon est ensuite décongelé et remis en suspension dans un tampon de lyse à l'aide d'une pipette ou par un mélange délicat au vortex, l'opération étant répétée plusieurs fois. Entre deux cycles, l'échantillon est centrifugé et le surnageant contenant les protéines solubles est conservé.
• Choc osmotique : Cette méthode très douce peut être suffisante pour la lyse de cellules bactériennes ou de cellules de mammifères en suspension sans utilisation de détergent. Souvent associée à une fragmentation mécanique, cette méthode repose sur le passage d'un milieu à forte pression osmotique à un milieu à faible pression osmotique. Elle convient bien aux applications où le lysat doit ensuite être fractionné en composants subcellulaires.
• Ultrasonication : Cette technique d'extraction protéique est très souvent utilisée sur les suspensions cellulaires. Les cellules sont lysées par des ondes sonores à haute fréquence produites par une sonde plongée dans l'échantillon. Ces ondes sonores créent une zone de basse pression qui rompt les membranes cellulaires.
• Méthodes mécaniques : Les protéines peuvent être extraites des cellules et des tissus par des moyens simples mais efficaces de fragmentation et de broyage. Par exemple, les membranes cellulaires peuvent être rompues par des forces de cisaillement liquide à l'aide d'un homogénéiseur ou d'un broyeur de tissus de type Dounce ou Potter-Elvehjem. Les tissus peuvent être homogénéisés par hachage ou broyage dans un tampon froid à l'aide d'un blender Waring ou d'un homogénéiseur Polytron®. Il est également possible de congeler les tissus ou les cellules dans de l'azote liquide, puis de les broyer en une poudre fine à l'aide d'un mortier et d'un pilon en présence d'oxyde d'aluminium ou de sable. Une agitation rapide des cellules en présence de fines billes de verre détruit les parois cellulaires. Cette méthode est efficace sur la majorité des bactéries à Gram positif et à Gram négatif.
• Digestion enzymatique : Digestion enzymatique : Des méthodes de digestion enzymatique sont souvent utilisées pour extraire les protéines des bactéries, des levures ou des cellules eucaryotes incluses dans des tissus fibreux, où les membranes cellulaires sont entourées d'une structure protectrice robuste. Les enzymes ou cocktails d'enzymes de lyse cellulaire tels que le lysozyme, la mutanolysine, le métapolyzyme, la lysonase et la pronase peuvent être utilisés conjointement avec des enzymes de digestion tissulaire (à savoir, la collagénase, la chondroïtinase, l'hyaluronidase) pour dissoudre ou rompre les parois cellulaires, les enveloppes, les capsules, les capsides et autres structures difficiles à cisailler par des méthodes mécaniques seules. La digestion enzymatique peut être suivie d'une homogénéisation, d'une sonication ou d'un mélange vigoureux au vortex dans un tampon de lyse.

De plus, étant donné que la lyse cellulaire peut libérer des protéases et des phosphatases endogènes susceptibles de dégrader la molécule cible, les échantillons doivent être protégés par des inhibiteurs de protéases et de phosphatases pendant la lyse cellulaire et la purification ultérieure afin d'éviter une perte incontrôlée de la cible.