Synthèse d'ARNm pour le développement de vaccins et d'agents thérapeutiques

• Comment les vaccins à ARNm induisent l'immunité
• Avantages de l'ARNm comme modalité vaccinale
• Préparation d'ADN plasmidique (ADNp) pour la synthèse d'ARNm
• Transcription et coiffage in vitro de l'ARNm
• Réactifs de synthèse d'ARNm pour la transcription in vitro (IVT)
• Purification et analyse de l'ARNm
• Élimination de l'ARNdb pendant la synthèse de l'ARNm
• Réactifs pour la purification et l'analyse d'ARNm de synthèse

La faculté de l'ARNm de synthèse à récapituler la fonction de l'ARNm mature a augmenté son potentiel pour un éventail d'applications biopharmaceutiques. Parmi ces thérapeutiques, l'on compte la production in vivo d'ARNm pour le remplacement de protéines, l'induction de cellules souches ou les immunothérapies anticancéreuses. D'importantes utilisations pharmaceutiques ont vu le jour récemment, en particulier de nouvelles approches pour les vaccins contre les maladies infectieuses. L'on peut notamment citer les vaccins à base d'ARNm qui protègent contre le SARS-CoV-2.

Pour des produits et solutions complets de vaccins à ARNm, veuillez vous référer à notre page Développement et production de vaccins.

COMMENT LES VACCINS À ARNm INDUISENT L'IMMUNITÉ

Les vaccins à base d'ARN messager (ARNm) émanent du dogme central selon lequel l'ARNm code pour les protéines. Cette modalité vaccinale simple induit une réponse immunologique en délivrant l'élément génétique qui code pour tout ou partie d'une protéine antigénique sous la forme d'une molécule prête pour la transcription. L'ARNm qui code pour l'antigène cible est capté par les cellules présentatrices d'antigène et traduit en protéine pathogène cible, ce qui à son tour induit une réponse immunitaire. Cette approche s'inspire étroitement du processus naturel par lequel les virus infectent les cellules.

AVANTAGES DE L'ARNm COMME MODALITÉ VACCINALE

Généralement, les vaccins à ARNm sont produits par synthèse in vitro au travers d'un processus enzymatique. Le développement et la fabrication de vaccins à ARNm sont des processus relativement simples par rapport aux modalités plus traditionnelles et leur réalisation nécessite peu de temps. Cette caractéristique les rend optimaux pour un développement et une mise à l'échelle accélérés. Cela s'est plutôt avéré essentiel dans la gestion des politiques de santé publique émergentes. Des innovations dans la conception et la formulation de vaccins à ARNm permettant d'en améliorer la thermostabilité pour éviter la distribution des vaccins avec respect de la chaîne du froid aideraient à réduire les coûts de production et améliorer l'accessibilité mondiale. 

PRÉPARATION D'ADN PLASMIDIQUE (ADNp) POUR LA SYNTHÈSE D'ARNm

Pour la conception de vaccins à base d'ARNm, la transcription in vitro d'une matrice d'ADN plasmidique (ADNp) est généralement utilisée pour produire de l'ARNm synthétique fonctionnel. Le vecteur plasmidique contient habituellement les éléments suivants : un promoteur amont exclusivement reconnu par l'ARN polymérase T7, SP6 ou T3, toutes issues de bactériophages ; 5' UTR, ADNc, 3' UTR, une queue poly A en aval et un site de clivage unique en aval de la queue poly A.

Figure 1. Génération de plasmide pour la transcription in vitro (IVT). Suite à la synthèse du gène, le clonage de l'ADN cible utilise un vecteur plasmidique (ADNp). L'ADNp est développé en culture bactérienne, puis purifié à l'aide de méthodes de purification d'acide nucléique, telles que des membranes à base de silice dans des colonnes à centrifuger.

TRANSCRIPTION ET COIFFAGE IN VITRO DE L'ARNm

L'ARN polymérase de bactériophage est normalement utilisée pour transcrire l'ADN plasmidique linéarisé. L'ADNp est d'abord linéarisé avec l'enzyme de restriction unique sélectionnée. Après digestion, l'ADNp linéarisé peut être purifié à l'aide de méthodes telles que le protocole phénol-chloroforme ou le Kit de purification GenElute PCR. Pour une purification à grande échelle, la filtration à flux tangentiel (TFF) est souvent conseillée, car elle peut être facilement transposée à l'échelle supérieure. Une fois la linéarisation effectuée, la transcription et le coiffage in vitro sont réalisés dans une solution mixte d'ARN polymérase recombinante (T7, T3 ou SP6) et de nucléosides triphosphates, plus un analogue de coiffe tel que le réactif CleanCap^® ou l'ARCA (Anti-Reverse Cap Analog). Le nucléoside modifié tel que le N1-méthylpseudouridine-5'-triphosphate (N1-méthylpseudo-UTP, 1-méthylpseudo-UTP) peut être utilisé en remplacement du GTP pour supprimer le système immunitaire inné. Il est notamment utilisé dans les vaccins à ARNm actuels.  L'efficacité du coiffage de l'ARNm avec l'ARCA est de 70 à 80 % en moyenne car il entre en concurrence avec le GTP, tandis que le rendement de l'ARNm est réduit d'environ un quart par rapport à la synthèse d'ARNm standard.  En comparaison, il a été démontré que le réactif CleanCap^® fonctionne avec une efficacité de coiffage de 94 % sans affecter le rendement de production d'ARNm. Par ailleurs, le coiffage peut être réalisé en effectuant la transcription sans analogue de coiffage, en utilisant à la place le complexe de coiffage codé par le virus de la vaccine (enzyme de coiffage, 2'-O-méthyltransférase, GTP et S-adénosyl méthionine (SAM)). L'efficacité de coiffage diffère en fonction de la structure secondaire de l'ARNm d'intérêt. Enfin, lorsque la longueur de la queue poly A de l'ADNp matrice est insuffisante (jusqu'à 150 bases), elle peut être allongée par l'utilisation de l'enzyme poly A.

Figure 2. La synthèse de l'ARNm est complétée par la linéarisation de l'ADNp, la transcription in vitro (IVT) de l'ARNm à l'aide de méthodes acellulaires et le coiffage de l'ARNm à l'aide d'un analogue de coiffage ou d'un complexe de coiffage codé par un virus.

PURIFICATION ET ANALYSE DE L'ARNm

La première étape de la purification de l'ARNm consiste à éliminer la matrice d'ADNp linéarisée à l'aide d'une désoxyribonucléase ou DNase. L'ARNm est ensuite précipité avec du chlorure de lithium (LiCl), et lavé avec de l'éthanol à 75 %. Les culots d'ARNm qui en résultent peuvent être remis en suspension avec de l'eau ou un tampon de remise en suspension. Cette méthode de précipitation doit cependant être évitée lors de la transposition à l'échelle supérieure, d'une part du fait de la difficulté de sa mise à l'échelle et d'autre part, parce que l'utilisation de solvants dangereux doit être évitée dans le cadre de la production GMP. Le Kit GenElute™ ARNm Miniprep est recommandé pour une purification à plus petite échelle. À plus grande échelle, la filtration à flux tangentiel (TFF) peut être réalisée à l'aide de cassettes Pellicon^® et sa transposition peut se faire de manière linéaire.

ÉLIMINATION DE L'ARNdb PENDANT LA SYNTHÈSE DE L'ARNm

L'ARN double brin ou ARNdb, sous-produit de la transcription, est un élément majeur de la synthèse de l'ARNm. L'ARNdb peut stimuler les réponses immunitaires innées qui agissent pour réduire la transcription de l'ARNm délivré. Lorsque l'ARNm est synthétisé pour le développement de vaccins, l'ARNdb doit donc être éliminé. La purification à base de cellulose à l'aide de fibres de cellulose peut être appliquée pour l'élimination de l'ARNdb à différentes échelles.