Principes de base de la PCR quantitative
A Technical Guide to PCR Technologies
La détection par PCR quantitative (officiellement PCR quantitative en temps réel ou qPCR) s'appuie sur la technique de PCR de base et permet d'estimer la quantité de matériel de départ présente dans un échantillon. Étant donné que les produits sont détectés au fur et à mesure de l'avancement de la réaction, la qPCR offre une plage dynamique d'analyse bien plus large que la PCR en point final classique : une seule PCR permet de détecter entre 1 et environ 1011 copies. La PCR quantitative en temps réel et la détection ultérieure des amplicons sont réalisées dans un tube fermé, ce qui permet d'éviter les manipulations post-PCR, comme l'électrophorèse sur gel, et diminue sensiblement le risque de contamination croisée.
Cette page explique les principes de base de la qPCR. Les mécanismes des principales réactions de détection sont décrits sur la page Méthodes de détection en PCR quantitative et digitale.
Principes de base
En qPCR, un colorant rapporteur fluorescent est utilisé comme mesure indirecte de la quantité d'acide nucléique présente à chaque cycle d'amplification. L'augmentation du signal de fluorescence est directement proportionnelle à la quantité de produits de PCR (amplicons) qui s'accumule exponentiellement au cours des étapes répétées de la réaction (voir la page sur la PCR). Les molécules rapporteuses se classent dans différentes catégories : colorants se fixant à l'ADN double brin (ADNdb), colorants conjugués aux amorces, ou oligonucléotides supplémentaires conjugués à un colorant appelés sondes (voir Méthodes de détection en PCR quantitative et digitale).
L'utilisation d'un colorant se fixant à l'ADNdb, comme le colorant SYBR® Green I, est la réaction de détection la plus simple. À l'état libre en solution ou en présence d'ADN simple brin (ADNsb), le colorant SYBR Green I émet un signal lumineux de faible intensité. À mesure que la PCR progresse et que la quantité d'ADNdb augmente, davantage de colorant se fixe aux amplicons, intensifiant le signal émis.
Une autre solution consiste à utiliser une sonde (ou une combinaison des deux, selon la réaction de détection) pour ajouter un niveau de spécificité à la détection puisque la sonde se fixe à une région spécifique de la matrice située entre les amorces. Le format de sonde le plus courant est la sonde à double marquage (DLP pour "Dual-Labeled Probe", également appelée sonde à hydrolyse ou sonde TaqMan®). Il s'agit d'un oligonucléotide portant un marqueur fluorescent en 5', par exemple 6-FAM™, et une molécule d'extinction en 3', par exemple l'un des "dark quenchers" que sont les extincteurs de fluorescence BHQ®1 ou OQ™ (voir Méthodes de détection en PCR quantitative et digitale). Conçues pour s'hybrider sur la matrice entre les deux amorces, ces sondes sont utilisées avec une ADN polymérase qui possède une activité exonucléase 5'→3' naturelle. Lorsque la sonde à double marquage est libre en solution, l'intensité du signal est faible, car le colorant rapporteur se trouve à proximité du groupement extincteur. Plus la réaction génère de matrice, plus les sondes s'hybrident sur cette dernière et plus elle est clivée par l'activité exonucléase 5'→3' de l'ADN polymérase qui progresse. Le signal de fluorescence s'intensifie à mesure que le colorant rapporteur en 5' est libéré dans la solution. L'utilisation de sondes marquées par différents colorants rapporteurs permet de détecter et de quantifier simultanément plusieurs cibles en une seule et même réaction (multiplex).
Une qPCR type est composée de cycles répétés d'incubations à des températures alternées (protocole de thermocyclage 3.1). Ce profil est souvent utilisé lorsque des colorants se fixant à l'ADNdb, des balises moléculaires (sondes Molecular Beacons) ou des sondes Scorpion® sont choisis comme méthode de détection pour la qPCR. L'extension des amorces est plus efficace à 72 °C. Il s'agit en effet de la température de processivité optimale de la plupart des ADN polymérases. À 72 °C, la polymérisation se produit à une vitesse d'environ 100 bases par seconde. À plus basse température, la processivité reste toutefois suffisante pour amplifier de courtes matrices. Les amplicons de qPCR sont généralement plus courts (< 200 bases) que les produits de PCR classiques ; ainsi, lorsqu'on travaille avec des sondes à double marquage, l'élongation et l'hybridation sont souvent réalisées en une seule et même étape à 60 °C (protocole de thermocyclage 3.2).
Protocole de thermocyclage 3.1
Exemple de profil de qPCR standard utilisant un colorant se fixant à l'ADNdb, une balise moléculaire ou une sonde Scorpions®
- Dénaturation initiale : La température de la réaction est portée à 95 °C et l'échantillon est incubé pendant 2 à 10 minutes (selon le mécanisme de démarrage à chaud de la polymérase) afin de garantir la séparation de toutes les cibles complexes (ADNdb) et leur disponibilité sous forme monocaténaire pour une amplification.
- Thermocyclage :
- Dénaturation : La température de la réaction est augmentée à 95 °C pendant 10 secondes pour dénaturer tout l'ADNdb.
- Hybridation : La température est abaissée à 60 °C pendant 30 secondes pour favoriser la liaison des amorces et des sondes (le cas échéant) sur la matrice.
- Élongation : L'élongation qui s'ensuit se produit à une température plus élevée de 72 °C, optimale pour la processivité de la Taq polymérase. La durée de l'élongation dépend de la taille de l'amplicon (30 secondes par kilobase). Elle dépend aussi de la longueur souhaitée de l'amplicon ainsi que de l'enzyme utilisée. Compte tenu de la petite taille des amplicons de qPCR, l'élongation dure généralement 5 à 30 secondes.
- Dénaturation : La température de la réaction est augmentée à 95 °C pendant 10 secondes pour dénaturer tout l'ADNdb.
- Répétition : Les étapes 1 à 3 sont répétées, en général pendant 40 cycles.
Protocole de thermocyclage 3.2
Exemple de profil de qPCR avec thermocyclage en deux étapes pour la détection d'une sonde à double marquage
- Dénaturation initiale : La température est portée à 95 °C et le mélange réactionnel est incubé pendant 2 à 10 minutes (selon les propriétés de démarrage à chaud de la polymérase).
- Thermocyclage :
- Dénaturation : La température de la réaction est augmentée à 95 °C pendant 10 secondes pour dénaturer tout l'ADNdb.
- Hybridation et élongation : La température est abaissée à 60 °C pendant 30 secondes pour favoriser la liaison des amorces sur la matrice, et l'élongation qui s'ensuit se produit grâce à l'activité suffisante de l'ADN polymérase à cette température.
- Répétition : Les étapes 1 et 2 sont répétées, en général pendant 40 cycles.
L'évolution de la fluorescence au cours de la réaction est mesurée par un thermocycleur pour PCR en temps réel. Les instruments spécialement conçus pour la PCR en temps réel regroupent une unité de thermocyclage et une unité optique. L'unité optique émet une lumière de longueur d'onde appropriée pour exciter le fluorophore et détecte l'émission résultante. De nombreux instruments modernes sont équipés d'un écran intégré ou connectés à un moniteur externe qui permet de suivre la progression de la réaction (Figure 3.1).
Figure 3.1.Exemple de données de test de qPCR. A) Les différentes phases de la réaction. Ligne de base : La concentration initiale de la matrice est basse ; l'intensité de la fluorescence est donc trop faible pour être détectée et seul le signal du bruit de fond est visible. Phase exponentielle : Dès que le rendement de la cible a atteint le seuil de détection (ligne rouge), la réaction connaît une évolution exponentielle. Phase linéaire : Plus la concentration de la matrice augmente, plus le taux d'ADN polymérase disponible et la vitesse de la réaction diminuent. Plateau : La réaction atteint son rendement maximal. B) Chaque réaction est caractérisée par le cycle au cours duquel la fluorescence dépasse pour la première fois le seuil de détection, qui est appelé cycle de quantification (Cq). Si le matériel de départ est abondant, l'amplification est visible dès les premiers cycles et le Cq est faible. Si le matériel de départ est peu abondant, l'amplification est visible plus tardivement et le Cq est plus élevé. Cette corrélation entre la fluorescence, le Cq et la quantité de produit amplifié permet de quantifier la matrice sur une large plage dynamique.
Quantification et analyse d'ADNg cibles
La PCR quantitative en temps réel s'applique facilement à l'analyse d'ADNg cibles, qu'il s'agisse d'effectuer un génotypage ou une détermination des polymorphismes mononucléotidiques, une analyse des méthylations, un criblage de séquences transgéniques ou un contrôle des insertions et délétions.
Quantification et analyse d'ARNm transcrits
Une application courante de la qPCR est l'analyse de l'expression génique, par exemple la comparaison des concentrations d'ARNm d'un gène d'intérêt entre un échantillon témoin et un échantillon traité. L'ARNm peut être quantifié par RT-qPCR en une ou deux étapes (pour en savoir plus sur les réactions de transcription inverse, voir la page PCR quantitative en temps réel après transcription inverse).
RT-qPCR en deux étapes
Les réactions de transcription inverse et de qPCR sont réalisées successivement dans des tubes séparés. L'ARN total, ou plus rarement l'ARN poly(A)+, sert de matériel de départ et l'ADNc est produit par élongation à partir d'amorces oligo(dT), d'amorces aléatoires, d'un mélange d'amorces oligo(dT) et d'amorces aléatoires, ou d'amorces spécifiques d'un gène, avec une transcriptase inverse. Une aliquote de ce mélange réactionnel est ensuite ajoutée à la qPCR.
RT-qPCR en une étape
Lorsque les réactions de transcription inverse et de qPCR sont réalisées dans un seul et même tube, le protocole expérimental est plus simple et le risque de contamination plus faible puisqu'il n'est pas nécessaire de manipuler davantage l'échantillon.
Quantification et analyse d'ARNnc transcrits
La plupart des ARN non codants mesurent plus de 100 nucléotides de long et peuvent donc être détectés et quantifiés par RT-qPCR avec les mêmes techniques que pour l'analyse des ARNm. En revanche, les ARN non codants courts, comme les micro-ARN et les ARN interagissant avec les protéines PIWI, ont pratiquement la longueur d'une seule amorce de PCR. Il faut donc trouver une technique permettant d'allonger ces ARN courts avant de réaliser la qPCR. Les systèmes disponibles dans le commerce utilisent deux grandes approches : 1) l'utilisation d'une amorce pour transcription inverse en tige-boucle ("stemloop"), et 2) l'ajout d'une queue poly(A) (polyadénylation) suivie d'une transcription inverse avec une amorce adaptatrice oligo(dT) (Figure 3.2). Une autre méthode mise au point par Castoldi et al., mais non disponible dans le commerce, utilise la ligature d'une molécule adaptatrice sur tous les ARN de l'échantillon et la conception d'amorces spécifiques pour différencier les cibles recherchées1,2.
L'approche utilisant une amorce pour transcription inverse en tige-boucle a été mise au point et commercialisée par Applied Biosystems (actuellement Life Technologies/Thermo) pour une qPCR ultérieure avec une sonde TaqMan3. Comme le montre la Figure 3.2A, l'extrémité 5' de l'amorce pour transcription inverse peut s'apparier avec une région située à plusieurs nucléotides de son extrémité 3', pour créer une tige appariée séparée par une boucle non appariée. Tous les nucléotides, sauf les derniers de l'extrémité 3' de l'amorce pour transcription inverse, sont universels, c'est-à-dire qu'ils contiennent la même séquence dans toutes les amorces des micro-ARN. Les derniers nucléotides qui allongent l'extrémité 3' à partir de la tige sont complémentaires de l'extrémité 3' d'un micro-ARN cible. L'extension de l'amorce le long d'une matrice de micro-ARN crée un ADNc qui peut être amplifié avec une amorce sens spécifique du micro-ARN et une amorce antisens universelle, cette dernière étant complémentaire de l'extrémité 5' de l'amorce pour transcription inverse en tige-boucle.
Toutes les autres méthodes de qPCR de micro-ARN disponibles dans le commerce, dont notre marque MystiCq®, utilisent la polyadénylation pour allonger le micro-ARN, comme l'ont décrit Shi et Chiang4. La poly(A) polymérase (PAP), enzyme indépendante de la matrice, catalyse le transfert des résidus adénosine de l'ATP sur l'extrémité 3' de tout ARN. Comme le montre la Figure 3.2B, la transcription inverse peut alors être réalisée avec une amorce oligo(dT). Cette amorce comprend une séquence adaptatrice à son extrémité 5', permettant la réalisation ultérieure d'une qPCR avec une amorce sens qui est complémentaire d'un micro-ARN spécifique et une amorce antisens qui est complémentaire de la séquence adaptatrice.
![Transcription inverse et qPCR de micro-ARN](/deepweb/assets/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/qpcr/mirna-rt-q-pcr-ab/mirna-rt-q-pcr-ab.jpg "Il existe deux méthodes commerciales pour la transcription inverse et la qPCR de micro-ARN. A) Une amorce en boucle est utilisée pour initier l'étape de transcription inverse après hybridation sur l'extrémité 3' du micro-ARN. L'élongation de la PCR via cette boucle produit une combinaison du micro-ARN et d'une séquence universelle, qui est suffisamment longue pour pouvoir être amplifiée. B) L'ajout d'une queue poly(A) au micro-ARN crée un site d'initiation pour une amorce composée d'une région oligo(dT) et d'une séquence d'initiation universelle. Recherche sur les acides nucléiques. Oxford University Press. Reproduit avec l'aimable autorisation d'Oxford University Press au format "réutilisation dans un livre papier ou électronique" via Copyright Clearance Center.")
Figure 3.2.Il existe deux méthodes commerciales pour la transcription inverse et la qPCR de micro-ARN. A) Une amorce en boucle est utilisée pour initier l'étape de transcription inverse après hybridation sur l'extrémité 3' du micro-ARN. L'élongation de la PCR via cette boucle produit une combinaison du micro-ARN et d'une séquence universelle, qui est suffisamment longue pour pouvoir être amplifiée. B) L'ajout d'une queue poly(A) au micro-ARN crée un site d'initiation pour une amorce composée d'une région oligo(dT) et d'une séquence d'initiation universelle. Recherche sur les acides nucléiques. Oxford University Press. Reproduit avec l'aimable autorisation d'Oxford University Press au format "réutilisation dans un livre papier ou électronique" via Copyright Clearance Center.
Chacune des approches commerciales présente ses avantages et ses inconvénients. L'utilisation d'une amorce en tige-boucle permet de réaliser une RT-qPCR en deux étapes, tandis que la plupart des méthodes de polyadénylation nécessitent une étape de transcription inverse supplémentaire avant la qPCR. Il existe des produits qui permettent de combiner la polyadénylation et la transcription inverse en une seule réaction, pour une polyadénylation par PAP/RT-qPCR en 2 étapes. La détection peut cependant se révéler moins sensible avec cette méthode (données internes non publiées). À l'inverse, une polyadénylation suivie d'une transcription inverse donne un pool d'ADNc stable qui peut servir à détecter n'importe quel microARN, ARNm ou autre type d'ARN, soit immédiatement soit ultérieurement. L'approche tige-boucle/TaqMan nécessite quant à elle une amorce différente pour la détection de chaque micro-ARN. Plusieurs amorces en tige-boucle peuvent être ajoutées dans une même réaction de transcription inverse5 et des pools d'amorces pour transcription inverse spécifiques de plusieurs micro-ARN peuvent être achetés auprès de Life Technologies pour réaliser une transcription inverse multiplex. Cependant, aucune des deux approches ne permet la détection par qPCR de micro-ARN découverts ultérieurement, ni d'ARNm provenant d'un même ADNc. Le système décrit par Castoldi et al.1,2 est inédit, car il permet de détecter des ARNm, des précurseurs et des molécules de micro-ARN entièrement matures dans un même échantillon d'ARN total.
Matériel requis
Instruments
Bon nombre d'instruments de qPCR sont conçus pour permettre la réalisation d'un panel d'applications précis. Comparons par exemple les capacités de l'instrument à haut débit ABI 7900 avec chargement automatique de plaques de 384 puits, à l'instrument Eco fabriqué et commercialisé par Illumina qui n'accepte qu'une seule plaque de 48 puits. Le meilleur instrument est bien entendu celui qui répond aux besoins de la recherche. Il est préférable de choisir un instrument équipé d'un logiciel convivial, capable d'accomplir les fonctions les plus demandées et présentant une certaine flexibilité en matière de sortie de données, afin de faciliter les manipulations en aval avec des programmes d'analyse statistique. Cela permet de réduire le temps de formation du personnel, et donc, le délai d'obtention des premiers résultats. D'autres caractéristiques doivent également être prévues, comme un bloc de PCR parfaitement uniforme (écart absolu maximal de 2 pour 1 Cq sur 96 puits répliqués) et un système optique qui excite la fluorescence et en détecte l'émission avec la plus grande sensibilité et la plus grande régularité possible sur une large plage de longueurs d'onde. Cela laisse place à un large choix de fluorophores et permet un multiplexage. D'autres facteurs à prendre en compte sont les coûts de fonctionnement associés à certains consommables, par exemple lorsqu'une plaque de microtitration spéciale est utilisée pour les réactions, ainsi que la facilité de chargement des plaques ou tubes de format non standard.
Matrice
Il faut très peu de copies de l'acide nucléique cible (l'équivalent d'environ 100 pg d'ADNg ou d'ADNc) pour initier une qPCR. Afin de limiter le risque de contamination par des inhibiteurs de la réaction, on veillera à utiliser la plus petite quantité de matrice de départ permettant une quantification précise. Lorsque le matériel de départ est de l'ARN, la conception des amorces et un traitement à la DNase I permettent de limiter les signaux liés à une contamination par de l'ADNg.
Amorces
Que la réaction utilise un colorant se fixant à l'ADN double brin ou une détection chimique par sondes, la conception d'amorces qualitatives fait partie des étapes les plus importantes en amont d'une qPCR. Voir la page Conception de tests de PCR, qPCR ou dPCR pour plus de détails. Pour une sensibilité et une spécificité maximales, toutes les modifications nécessaires, comme l'acide nucléique bloqué, doivent être incluses (voir la page sur les réactions de détection en qPCR).
Sonde(s)
Lorsque la détection des amplicons est réalisée au moyen de sondes, les dimères d'amorces et les produits non spécifiques ne sont pas détectés. Ils doivent cependant être évités, car ils peuvent diminuer l'efficacité de la réaction. Pour une sensibilité et une spécificité maximales, on veillera à choisir le type de sonde adapté à l'application et à inclure toutes les modifications nécessaires, comme l'acide nucléique bloqué (voir la page sur les réactions de détection en qPCR).
dNTP
Les mélanges maîtres pour PCR ou qPCR standards contiennent du dATP, du dCTP, du dGTP et du dTTP. Il existe toutefois des mélanges où le dTTP est remplacé par du dUTP. Les produits de précédentes amplifications réalisées avec du dUTP contiennent de l'uracile à la place de la thymine ; ils sont donc clivables par l'uracile-ADN glycosylase (UNG). L'incubation préalable des amplifications ultérieures avec de l'UNG évite tout risque de contamination entre les réactions. Pour être efficaces, toutes les PCR réalisées en laboratoire doivent utiliser du dUTP.
Magnésium
La transcriptase inverse, la Taq polymérase et l'exonucléase 5'→3' de la Taq polymérase ont besoin de chlorure de magnésium (MgCl2) pour être actives. Pour les mélanges réactionnels contenant une sonde à double marquage, la concentration optimale de Mg2+ se situe généralement entre 3 mM et 6 mM. Si la plupart des mélanges maîtres contiennent du MgCl2, sa concentration doit parfois être optimisée ; un tube de MgCl2 pur supplémentaire est donc généralement fourni (voir Optimisation et validation des tests). Dans certains cas, un mélange réactionnel sans MgCl2 peut être nécessaire pour qu'une faible concentration puisse être utilisée, par exemple pour une détection par sondes Scorpion®.
Transcriptase inverse
Une transcriptase inverse donnant des rendements d'ADNc importants tout en conservant son activité à haute température est essentielle à la réussite d'une PCR quantitative après transcription inverse (RT-qPCR). Les performances à haute température contribuent à déstabiliser les régions de l'ARN qui possèdent une structure secondaire complexe et à les rendre accessibles pour l'hybridation et l'amplification ultérieure. Lors d'une RT-qPCR en une étape, une enzyme performante à chaud permet d'utiliser des amorces spécifiques du ou des gènes d'intérêt à haute température de fusion (Tm), ce qui augmente la spécificité de la réaction. Dans les protocoles en deux étapes, il est important de veiller à ce que l'enzyme donne un rendement d'ADNc linéaire et proportionnel à partir d'ARN (voir la page Transcription inverse pour en savoir plus sur l'évaluation de la transcription inverse).
Taq polymérase
Comme pour la transcriptase inverse, il est crucial de choisir la Taq polymérase la mieux adaptée à la réaction. Un problème majeur de la Taq polymérase naturelle est son activité résiduelle à basse température. Il en résulte l'hybridation non spécifique d'amorces, et donc, la formation de produits non spécifiques. Des Taq polymérases inhibées par un anticorps ou par un agent chimique (dites "à démarrage à chaud" ou "Hot Start") permettent de régler ce problème en neutralisant l'activité enzymatique jusqu'au démarrage de l'étape de dénaturation à haute température.
Tampon
Les tampons ou les mélanges maîtres pour PCR contiennent généralement des dNTP, une Taq polymérase, du MgCl2 et des stabilisants. Ils peuvent également contenir du SYBR Green I, du ROX™, de la fluorescéine et des colorants de charge inertes (témoins de charge), selon les besoins de la réaction, la méthode de détection et l'instrument utilisés. Les constituants du tampon de PCR et les stabilisants sont en général des produits exclusifs du fabricant. Acheter chaque ingrédient séparément permet de bénéficier d'une très grande souplesse d'utilisation, chacun d'eux étant ajouté individuellement à la dose optimale. À l'inverse, malgré une moindre souplesse d'utilisation, acheter les ingrédients sous forme de mélange maître augmente la reproductibilité inter-lot et la facilité d'emploi tout en réduisant le nombre d'étapes de pipetage, et donc, les risques d'erreur et de contamination.
Colorants témoins de charge
Avec certains thermocycleurs pour PCR en temps réel, un colorant de charge comme le ROX doit être inclus dans chaque réaction afin de réduire la variabilité au sein du système optique et de normaliser les différences d'intensité du signal. De même, certains thermocycleurs ont besoin d'un signal de fluorescéine initial pour créer un "fond virtuel" lors de la réalisation de tests avec le colorant SYBR Green I (très peu de bruit de fond). Ces colorants peuvent être présents dans le mélange maître ; ils peuvent aussi être fournis séparément, ce qui permet d'utiliser la bonne concentration.
Recommandations MIQE
Un problème évident lié à l'utilisation de la qPCR est qu'il est très facile de produire des chiffres qui peuvent être interprétés comme des résultats quantitatifs. Ces résultats peuvent cependant se révéler trompeurs. En effet, un contrôle qualité et une analyse poussée peuvent s'avérer nécessaires pour différencier les éventuels artéfacts dus à une mauvaise conception ou exécution du test ou à une analyse inappropriée des données. La publication de données apparemment significatives en l'absence des contrôles qualité appropriés donne lieu à des rapports qui sont, au mieux, non biologiquement ou cliniquement pertinents, et au pire, inexacts.
Chaque étape du processus expérimental de qPCR, de l'acquisition des échantillons à l'analyse des données, est sujette à variabilité6. Cette dernière peut ainsi apparaître au moment de la sélection ou du traitement des échantillons, de l'extraction des acides nucléiques (pouvant causer des différences de qualité qui limitent la reproductibilité de la détection des cibles par qPCR), de la conception ou de l'optimisation de tests (contribuant à des différences d'efficacité et de sensibilité des tests) ou de l'analyse des données (nécessitant une interprétation subjective et l'utilisation des bonnes méthodes statistiques). Il est primordial que les informations communiquées à un public scientifique contiennent les informations nécessaires à la conduite d'une analyse critique7, bien que cela ne soit visiblement pas toujours le cas8. Les recommandations MIQE ("Minimum Information for Publication of Quantitative Real-time PCR Experiments")9 tiennent compte de ces préoccupations. Ces recommandations ont pour but de renforcer la transparence en fournissant un socle minimal d'informations sur un test pour permettre au lecteur d'évaluer la validité technique d'une publication. Elles visent également à donner des conseils sur la conception, l'optimisation et la validation de nouveaux tests de qPCR.
Les recommandations MIQE sont structurées en neuf chapitres (protocole expérimental, échantillon, acides nucléiques, transcription inverse, cible, amorces et sondes, détail du test, thermocyclage et analyse des données ; consulter la page dédiée pour télécharger une liste de pointage, Tableau 1). Tous les paramètres concernent des informations qui doivent être obtenues au cours de la conception, de l'optimisation et de la validation des tests. Que les tests utilisés soient disponibles dans le commerce ou tirés de la littérature scientifique, leur optimisation et leur validation demeurent nécessaires. L'article sur les recommandations MIQE inclut une liste de pointage des facteurs dits "essentiels", qui sont jugés indispensables pour une bonne description du test de qPCR ; d'autres éléments sont qualifiés de "souhaitables", ce qui signifie qu'il s'agit d'informations utiles, mais pas indispensables pour que le test puisse être répliqué et les données de la publication évaluées. Il est important de comprendre qu'il est impératif d'indiquer l'efficacité de la PCR, la sensibilité analytique et la spécificité de chaque test et que ces informations doivent être déterminées par le chercheur dans les conditions du laboratoire. Certains éléments à prendre en compte pour la réalisation d'une PCR digitale (voir PCR digitale) ont été traités dans une récente publication sur les recommandations MIQE en PCR digitale10.
Respectez-vous les recommandations MIQE ?
"Minimum Information for Publication of Quantitative Real-time PCR Experiments" (informations minimales à fournir pour la publication de résultats de PCR quantitative en temps réel)
a Clinical Chemical. Copyright 2009. American Association For Clinical Chemistry, Inc. Reproduit avec l'aimable autorisation de l'American Association For Clinical Chemistry, Inc. au format "publication web" via Copyright Clearance Center.
b Toutes les informations essentielles doivent être fournies avec le manuscrit ; les informations souhaitables doivent être communiquées lorsqu'elles sont disponibles. Si les amorces proviennent de RTPrimerDB, des informations sur la cible de qPCR, les oligonucléotides, les protocoles et la validation du test sont disponibles dans la base de données du même nom.
c La vérification de l'absence d'ADN par un test d'absence de transcription inverse est essentielle lors de la première extraction de l'ARN. Une fois l'absence d'ADN confirmée dans l'échantillon, l'inclusion d'un témoin d'absence de transcription inverse n'est plus essentielle, mais souhaitable.
d La communication de la séquence des sondes est hautement souhaitable et vivement encouragée. Cependant, il ne peut s'agir d'une exigence essentielle dans la mesure où les fournisseurs de tests préconçus non commerciaux ne fournissent pas tous cette information. L'utilisation de ce type de test est déconseillée.
Références
Pour continuer à lire, veuillez vous connecter à votre compte ou en créer un.
Vous n'avez pas de compte ?