Lisi delle cellule ed estrazione delle proteine per il saggio di Western blotting

Tutti i passaggi per estrarre le proteine dalle cellule o dai tessuti (freschi o congelati) vanno eseguiti a 2-8 °C. Di seguito è indicata la composizione di un tampone di lisi comunemente usato per preparare i campioni proteici. Nella pagina Strumenti di calcolo e app è disponibile un elenco di ricette per tamponi e altre soluzioni per Western blotting.

Tampone RIPA per l’estrazione delle proteine, soluzione pronta all’uso (N° Cat. R0278)

• NaCl (S3014) 150 mM
  
• Triton X-100 (T8787) 1%
  
• Sodio deossicolato (D6750) 0,5%
  
• SDS (74255) 0,1%
  
• Tris-HCl (T1503) pH 8,0, 50 mM

Inibitori delle proteasi – per non perdere le proteine durante la preparazione del campione

Protocollo per l’estrazione delle proteine

1. Scartare il terreno nelle piastre di coltura e lavare le cellule con PBS ghiacciato.
   
2. Scartare il PBS e aggiungere il tampone di lisi ghiacciato.
   
3. Raschiare le cellule usando un raschietto per cellule di plastica previamente raffreddato. Trasferire le cellule in provette per microcentrifuga.
   
4. Agitare il contenuto delle provette per microcentrifuga per 30 minuti a 4 °C.
   
5. Centrifugare le provette a 16.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in provette nuove da posizionare poi nel ghiaccio. Scartare il pellet.

Estrazione delle proteine da cellule in sospensione

1. Centrifugare la sospensione cellulare a 2.000 x g per 5-7 minuti a 4 °C. Le cellule si accumulano sul fondo della provetta, scartare il surnatante.
   
2. Aggiungere PBS ghiacciato al pellet delle cellule, quindi lavare mediante centrifugazione a 2.000 x g per 5-7 minuti a 4 °C.
   
3. Aggiungere PBS ghiacciato al pellet delle cellule. Agitare il contenuto delle provette per microcentrifuga per 30 minuti a 4 °C.
   
4. Centrifugare le provette a 16.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in provette nuove da posizionare poi nel ghiaccio. Scartare il pellet.

Estrazione delle proteine da tessuti

1. Procedere alla dissezione del tessuto di interesse su ghiaccio. Trasferire il tessuto all’interno di provette per microcentrifuga a fondo arrotondato e congelare immergendo rapidamente in azoto liquido.
   
2. Per 5 mg di tessuto, aggiungere 300 µL di tampone di lisi ghiacciato e omogeneizzare con un omogeneizzatore elettrico. Durante l’omogeneizzazione, aggiungere altri 300-600 µL di tampone di lisi.
   
3. Agitare il contenuto delle provette per 2 ore a 4 °C.
   
4. Centrifugare le provette a 16.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in provette nuove da posizionare poi nel ghiaccio. Scartare il pellet.

Normalizzazione della concentrazione totale di proteine nei campioni

1. Prelevare un piccolo volume di lisato per effettuare la stima della quantità di proteine nel campione.
2. Determinare la concentrazione delle proteine nei propri campioni tramite comparazione con quella negli standard, accertandosi che gli standard siano stati diluiti con lo stesso tampone usato per i propri campioni. La stima delle proteine può essere eseguita utilizzando il Reagente Coomassie per il dosaggio delle proteine (N° Cat. 27813), saggio dell’acido bicinconinico (BCA), con assorbanza a 280 nm.
3. Trasferire il volume appropriato di ciascun lisato in provette per microcentrifuga in modo che tutti i campioni contengano la stessa concentrazione totale di proteine.
   
4. Aggiungere una quantità di tampone di lisi ghiacciato sufficiente per portare tutti i lisati allo stesso volume.

Miscelare i campioni con il tampone di Laemmli per il caricamento su gel.

Di seguito è riportata la composizione del tampone necessario per caricare i campioni nei pozzetti del gel per l’elettroforesi.

Tampone di Laemmli 2X per il caricamento:

• Blu di bromofenolo (N° Cat. B5525) 0,004%
• 2-mercaptoetanolo 10%
• Glicerolo (N° Cat. G5516) 20%
• SDS (N° Cat. 74255) 4%
• Tris-HCl (N° Cat. T1503) 0,125 M

1. A un dato volume di lisato cellulare, aggiungere un egual volume di tampone per il caricamento.
   
2. Far bollire questa miscela a 95 °C per 5 minuti. Centrifugare a 16.000 x g per 5 minuti.
   
3. Questi campioni possono essere conservati a -20 °C oppure usati direttamente nell’elettroforesi su gel.