Purificazione di peptidi sierici con filtri centrifughi Amicon^® Ultra per analisi in spettrometria di massa MALDI

I biomarcatori svolgono un ruolo fondamentale negli studi di drug discovery e nel processo di sviluppo di nuovi farmaci. Essi forniscono potenti indizi sulla suscettibilità genetica, sulla progressione di una malattia e sulla risposta ai farmaci. Il siero è una fonte fondamentale di biomarcatori proteici putativi. Uno dei principali ostacoli alla scoperta di nuovi biomarcatori è la presenza nel plasma o nel siero di sali, proteine e lipidi che interferiscono con le analisi dei peptidi mediante spettrometria di massa. Per estrarre e arricchire i peptidi dai tessuti e dai fluidi corporei è possibile utilizzare diversi protocolli:

• precipitazione delle proteine seguita da frazionamento mediante cromatografia in fase inversa su resina C18;
• precipitazione con acetonitrile delle proteine di maggiori dimensioni e contemporaneo aumento della solubilità delle proteine più piccole e dei peptidi;
• ultrafiltrazione per preparare le frazioni a basso peso molecolare ai fini dell’analisi di biomarcatori.^1–4

Un metodo comodo ed efficiente per la purificazione dei peptidi sierici è costituito dall’ultrafiltrazione in combinazione con l'estrazione in fase solida (SPE) su resina C18. Questo approccio consente di ottenere un maggior numero di peptidi per l'analisi in spettrometria di massa rispetto al metodo della precipitazione con acetonitrile. Inoltre, la tecnica di preparazione del campione assistita da filtro (FASP), originariamente sviluppata con i nostri filtri centrifughi Microcon^®5, è stata recentemente ottimizzata per l’impiego con le unità centrifughe Amicon^® Ultra⁶.

Uno dei vantaggi della FASP è che essa consente di operare lo scambio di tampone e la concentrazione dei campioni attraverso diversi cicli di centrifugazione senza problemi di essiccamento/ precipitazione. Inoltre, questa tecnica è stata adattata al formato a 96 pozzetti con le nostre piastre filtranti MultiScreen^®7, consentendo di processare rapidamente i materiali biologici e aprendo la strada all’automazione del metodo FASP nel futuro.

Metodi

I. Preparazione dei peptidi sierici

1. Diluire da 1 a 4 mL di siero, plasma o lisato cellulare con acetonitrile al 10%, o con tampone tris HCL 10-20 mM a pH 7,5, in rapporto 1:1.
2. Caricare il campione in un filtro centrifugo Amicon^® Ultra-4 con NMWL di 10K e centrifugare in un rotore basculante per 15-30 minuti a 3.000 x g.
3. Raccogliere il filtrato.
4. Se il campione contiene acetonitrile, introdurlo in un concentratore sottovuoto per evaporare il reagente; altrimenti passare direttamente al punto 5.
5. Acidificare 10 μL di filtrato con 5 μL di TFA all’1%.
6. Dissalare, concentrare e purificare il campione, seguendo il protocollo definito per i puntali ZipTip^® μC18.
7. Eluire il campione direttamente su una piastra target MALDI con 2 μL di matrice di acido ∂-ciano-4-idrossicinnamico (5 mg/mL in acetonitrile al 50%, TFA 0,1%). N.B. Se prima della filtrazione si è aggiunto dell’acetonitrile al siero, centrifugare brevemente i campioni in una Speed Vac^® per rimuovere il solvente, prima della purificazione con ZipTip^®.

II. Analisi dei peptidi mediante spettrometria di massa sul filtrato degli ultrafiltri centrifughi Amicon^® Ultra da 4 mL, 10kDa

1. Acidificare gli ultrafiltrati di lisato cellulare o di siero, contenenti i peptidi, con TFA all’1% e concentrarli su puntali ZipTip^® μC18 o ZipTip^® a scambio cationico forte seguendo la procedura descritta nel manuale d’uso.
2. Depositare il campione con 1 μL di matrice di acido ∂-ciano-4-idrossicinnamico (5 mg/mL in acetonitrile al 50%, TFA 0,1%) e analizzarlo in uno spettrometro di massa MALDI.

III. Preparazione dei peptidi sierici mediante precipitazione con acetonitrile (campioni di controllo)

1. Diluire i campioni di siero come indicato al punto 1 del protocollo I, aggiungendo acetonitrile al 10% in rapporto 1:1 (v:v).
2. Caricare il campione in una provetta da centrifuga da 15 mL e centrifugare per precipitare le proteine.
3. Raccogliere il surnatante e far evaporare l’acetonitrile in una centrifuga speed-vac.
4. Risospendere il campione in TFA allo 0,1%, dissalare e concentrare con puntali ZipTip^® μC18.
5. Coeluire direttamente su una piastra target MALDI con 2 μL di matrice di acido ∂-ciano-4-idrossicinnamico (5 mg/mL in acetonitrile al 50%, TFA 0,1%).

Risultati

I dispositivi centrifughi Amicon^® Ultra-4 con NMWL di 30K possono essere utilizzati ai fini della preparazione di peptidi sierici per analisi in spettrometria di massa ad alta risoluzione. La qualità dei dati, confrontata con quella di siero di ratto non processato, migliora dopo la rimozione delle proteine di grandi dimensioni mediante precipitazione con acetonitrile (Figura 1A, B, qui sotto). Il numero e la qualità dei peptidi rivelati con la tecnologia MALDI-TOF risultano nettamente incrementati dopo l'ultrafiltrazione del siero (Figura 1C, sottostante).

La qualità dei dati è stata ulteriormente migliorata integrando la cromatografia a fase inversa nel protocollo per la preparazione dei campioni, da sola o combinata alla precipitazione con acetonitrile e all’ultracentrifugazione (Figura 2, qui sotto). Qui i puntali ZipTip^® μC18 sono stati sfruttati come uno strumento comodo ed efficiente per la preparazione di campioni su micro-scala prima della spettrometria di massa. La massima intensità di segnale, il più alto rapporto segnale/ rumore di fondo e il numero massimo di peptidi rivelati sono stati ottenuti con i campioni preparati utilizzando tutti e tre i metodi (Figura 2D, sottostante).

Questo approccio può essere usato direttamente, in combinazione con i puntali ZipTip^® μC18, per l’identificazione dei peptidi con tecnica MS/MS, oppure come primo stadio prima del successivo arricchimento superficie-mediato in metodi SELDI-TOF. Questi protocolli potrebbero essere applicabili anche a marcatori a basso peso molecolare, come farmaci e metaboliti.