Protocolli per saggi ELISA

• Procedura del saggio ELISA a sandwich
• Procedura del saggio ELISA per la determinazione della fosforilazione
• Procedura del saggio EIA
• Procedura del saggio ELISA su cellule

Procedura del saggio ELISA a sandwich

1. Portare tutti i reagenti e i campioni a temperatura ambiente (18-25 °C) prima dell’uso. Si raccomanda di analizzare tutti gli standard e i campioni almeno in duplicato.
2. Aggiungere 100 μL di ciascuno standard e campione nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti e incubare per 2,5 ore a temperatura ambiente o per tutta la notte a 4 °C sotto leggera agitazione.
3. Scartare la soluzione, quindi lavare 4 volte con la soluzione di lavaggio 1X. Il lavaggio va effettuato riempiendo ogni pozzetto con il tampone di lavaggio (300 µL) utilizzando una pipetta multicanale oppure con un sistema di lavaggio automatizzato. La rimozione di tutto il liquido a ogni passaggio è essenziale per la buona riuscita della procedura. Dopo l’ultimo lavaggio, rimuovere tutto il tampone di lavaggio rimanente mediante decantazione o aspirazione. Capovolgere la piastra e tamponarla su fogli di carta da filtro puliti.
4. Aggiungere 100 µL dell’anticorpo di rivelazione 1x preparato a ogni pozzetto. Coprire i pozzetti e incubare per 1 ora a temperatura ambiente sotto leggera agitazione.
5. Scartare la soluzione. Ripetere la procedura di lavaggio descritta al punto 3.
6. Aggiungere 100 µL della soluzione di streptavidina preparata a ogni pozzetto. Coprire i pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente sotto leggera agitazione.
7. Scartare la soluzione. Ripetere la procedura di lavaggio descritta al punto 3.
8. Aggiungere 100 µL del substrato, ossia il reagente TMB One-Step Substrate (articolo H), a ogni pozzetto. Coprire i pozzetti e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio sotto leggera agitazione.
9. Aggiungere 50 µL della soluzione per fermare la reazione, ossia la Stop Solution (articolo I) a ogni pozzetto. Leggere immediatamente l’assorbanza a 450 nm.

Procedura del saggio ELISA per la determinazione della fosforilazione

1. Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (18-25 °C) prima dell’uso. Si raccomanda di analizzare tutti i campioni e il controllo positivo almeno in duplicato.
2. Aggiungere 100 μL di ciascun campione o controllo positivo nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti con il supporto per piastre e incubare per 2,5 ore a temperatura ambiente o per tutta la notte a 4 °C sotto agitazione.
3. Scartare la soluzione, quindi lavare 4 volte con la soluzione di lavaggio 1X. Il lavaggio va effettuato riempiendo ogni pozzetto con il tampone di lavaggio (300 µL) utilizzando una pipetta multicanale oppure con un sistema di lavaggio automatizzato. La rimozione di tutto il liquido a ogni passaggio è essenziale per la buona riuscita della procedura. Dopo l’ultimo lavaggio, rimuovere tutto il tampone di lavaggio rimanente mediante aspirazione. Capovolgere la piastra e tamponarla su fogli di carta da filtro puliti.
4. Aggiungere 100 µL dell’anticorpo anti-fosfotirosina biotinilato 1X preparato a ogni pozzetto. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente sotto agitazione.
5. Scartare la soluzione. Ripetere la procedura di lavaggio descritta al punto 3.
6. Aggiungere 100 µL della soluzione di HRP-streptavidina 1X preparata (cfr. al punto 6 “Preparazione dei reagenti”) a ogni pozzetto. Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione.
7. Scartare la soluzione. Ripetere la procedura di lavaggio descritta al punto 3.
8. Aggiungere 100 µL del substrato, ossia il reagente TMB One-Step Substrate (articolo H), a ogni pozzetto. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio sotto agitazione.
9. Aggiungere 50 µL della soluzione per fermare la reazione, ossia la Stop Solution (articolo I) a ogni pozzetto. Leggere immediatamente a 450 nm.

Procedura del saggio EIA

1. Durante la preparazione mantenere i reagenti del kit su ghiaccio. Si raccomanda di analizzare tutti gli standard e i campioni almeno in duplicato.
2. Aggiungere 100 µL di anticorpo anti-“bersaglio” a ogni pozzetto. Incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente sotto leggera agitazione (1-2 cicli/sec). L’incubazione può anche continuare per una notte a 4 °C.
3. Scartare la soluzione e lavare i pozzetti per 4 volte con il tampone di lavaggio 1X (200-300 μL per ciascun lavaggio). Questa operazione può essere eseguita con una pipetta multicanale o con un sistema di lavaggio per piastre automatizzato. La rimozione di tutto il liquido a ogni passaggio è essenziale per la buona riuscita della procedura. Dopo l’ultimo lavaggio, rimuovere tutto il tampone di lavaggio rimanente mediante decantazione o aspirazione. Capovolgere la piastra e tamponarla su fogli di carta da filtro puliti.
4. Aggiungere 100 μL di ciascuno standard, controllo positivo e campione nei rispettivi pozzetti. Ricordarsi di includere un pozzetto per il bianco (solo diluente). Coprire i pozzetti e incubare per 2,5 ore a temperatura ambiente sotto leggera agitazione (1-2 cicli/sec) o una notte a 4 °C.
5. Scartare la soluzione, quindi lavare 4 volte come indicato al punto 3.
6. Aggiungere a ogni pozzetto 100 μL della soluzione di HRP-streptavidina preparata. Incubare per 45 minuti sotto leggera agitazione a temperatura ambiente. Si raccomanda di non incubare per periodi più brevi o più lunghi di 45 minuti.
7. Scartare la soluzione, quindi lavare 4 volte come indicato al punto 3.
8. Aggiungere 100 µL del substrato, ossia il reagente TMB One-Step Substrate (articolo H), a ogni pozzetto. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio sotto leggera agitazione (1-2 cicli/sec).
9. Aggiungere 50 µL di Stop Solution (articolo I) a ogni pozzetto. Leggere immediatamente l’assorbanza a 450 nm.

Procedura del saggio ELISA su cellule

NOTA: TUTTE le incubazioni e i lavaggi vanno effettuati sotto leggera agitazione o rotazione (1-2 cicli/sec).

1. Progettazione dell’esperimento.
   SUGGERIMENTO: se si seminano cellule HUVEC, HMEC‐1 o cellule scarsamente aderenti, rivestire la micropiastra a 96 pozzetti non rivestiti (articolo A) aggiungendo 100 μL di poli‐L‐lisina (si raccomanda di usare il prodotto di N° Cat. P4832 di Sigma-Aldrich) a ogni pozzetto e quindi attenersi alle istruzioni del produttore. L’articolo A può essere sostituito con una micropiastra già rivestita, tipo CellBIND^®, o con una piastra per colture tissutali trattata con poli‐lisina.
2. Seminare 100 μL contenenti da 10.000 a 30.000 cellule in ogni pozzetto della micropiastra a 96 pozzetti non rivestiti (articolo A) in dotazione e incubate per una notte a 37 °C con CO₂ al 5%.
   NOTA: il numero ottimale di cellule varia a seconda della linea cellulare e della quantità relativa di fosforilazione delle proteine. L’uso di un numero maggiore o inferiore di cellule va stabilito empiricamente. NOTA: le cellule vanno mantenute in condizioni di "affamamento" (starvation) per circa 4‐24 ore (a seconda della linea cellulare) prima del trattamento con inibitori o attivatori.         
3. Applicare i vari trattamenti, inibitori (come siRNA o sostanze chimiche) o attivatori attenendosi alle istruzioni del produttore e incubare per i tempi desiderati. 
   NOTA: prima di trattare le cellule, si raccomanda di dissolvere gli inibitori o gli attivatori in terreno per colture cellulari privo di siero (salvo diversamente indicato dalle istruzioni del produttore).       
4. Scartare il terreno di coltura capovolgendo la micropiastra sopra un lavandino e picchiettandone delicatamente il fondo.
5. Lavare pipettando 200 µL del tampone di lavaggio A 1X (articolo B) preparato in ogni pozzetto. Scartare il tampone di lavaggio (cfr. punto 4) e lavare altre 2 volte per un totale di 3 lavaggi utilizzando ogni volta del tampone di lavaggio fresco. Dopo il lavaggio finale, tamponare delicatamente la micropiastra su un foglio di carta da filtro per rimuovere tutto il tampone in eccesso/rimasto.
   NOTA: per evitare di perdere cellule, non pipettare direttamente sopra le cellule, ma far scendere lentamente il liquido lungo la parete del pozzetto. Evitare anche di usare il vuoto per aspirare la soluzione o di picchiettare troppo forte la micropiastra.       
6. Aggiungere 100 µL della soluzione fissante (articolo D) a ogni pozzetto e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: la soluzione fissante serve a permeabilizzare le cellule.  
7. Ripetere il lavaggio come al punto 5.
8. Aggiungere a ogni pozzetto 200 µL del tampone di smorzamento (quenching) 1X (articolo E) preparato e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: il tampone di smorzamento serve per minimizzare il segnale di background.  
9. Lavare 4 volte con il tampone di lavaggio A 1X.
10. Aggiungere a ogni pozzetto 200 µL del tampone bloccante 1X (articolo F) preparato e incubare per 1 ora a 37 °C. 
    
11. Lavare per 3 volte con il tampone di lavaggio B 1X (articolo C) preparato.
    NOTA: se necessario, dopo questo lavaggio la micropiastra può essere conservata a ‐80 °C per molti giorni.
12. Aggiungere ai pozzetti appropriati 50 µL dell’anticorpo primario 1X (articolo G‐1, G‐2, G‐3, H‐ 1, H‐2 o H‐3) preparato e incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
13. Lavare 4 volte con il tampone di lavaggio B 1X.
14. Aggiungere a ogni pozzetto 50 µL dell’anticorpo secondario coniugato con HRP 1X (articolo I-2) preparato e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
15. Ripetere il punto 13.
16. Aggiungere 100 µL del substrato TMB (articolo J) a ogni pozzetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
17. Aggiungere 50 μL di soluzione di interruzione (articolo K) a ogni pozzetto. Leggere immediatamente a 450 nm.

Questi protocolli sono da intendersi come indicazioni di massima, quindi per le istruzioni precise fare riferimento al bollettino tecnico dettagliato di ogni kit.