Lyse cellulaire et extraction protéique pour le western blotting

Toutes les étapes de l'extraction de protéines à partir de cellules ou de tissus (frais ou congelés) doivent être réalisées entre 2 °C et 8 °C. Retrouvez ci-dessous la composition d'un tampon de lyse couramment utilisé pour préparer des échantillons de protéines. La page Calculateurs propose une liste de recettes de tampons et d'autres solutions pour le western blotting.

Tampon RIPA pour l'extraction des protéines, solution prête à l'emploi (réf. R0278)

• NaCl (S3014) 150 mM
  
• Triton X-100 (T8787) 1 %
  
• Désoxycholate de sodium (D6750) 0,5 %
  
• SDS (74255) 0,1 %
  
• Tris-HCl (T1503), pH 8,0, 50 mM

Inhibiteurs de protéases : ne perdez pas vos protéines en préparant vos échantillons

Étapes du protocole d'extraction des protéines

1. Jeter le milieu recouvrant les cellules dans les boîtes de culture et laver les cellules au PBS glacé.
   
2. Jeter le PBS, ajouter le tampon de lyse glacé.
   
3. Racler les cellules à l'aide d'un grattoir en plastique froid. Recueillir les cellules dans des microtubes à centrifuger.
   
4. Agiter le contenu des microtubes pendant 30 minutes à 4 °C.
   
5. Centrifuger les microtubes à 16 000 × g pendant 20 minutes à 4 °C. Recueillir le surnageant dans un tube propre et le placer sur de la glace. Jeter le culot.

Extraction de protéines à partir de cellules en suspension

1. Centrifuger la suspension de cellules à 2 000 × g pendant 5 à 7 minutes à 4 °C. Les cellules se déposent au fond du tube ; jeter le surnageant.
   
2. Ajouter du PBS glacé au culot de cellules et laver les cellules en les centrifugeant à 2 000 × g pendant 5 à 7 minutes à 4 °C.
   
3. Ajouter du tampon de lyse glacé au culot de cellules. Agiter le contenu des microtubes pendant 30 minutes à 4 °C.
   
4. Centrifuger les microtubes à 16 000 × g pendant 20 minutes à 4 °C. Recueillir le surnageant dans un tube propre et le placer sur de la glace. Jeter le culot.

Extraction de protéines à partir de tissus

1. Disséquer le tissu d'intérêt sur de la glace. Le transférer dans des microtubes à centrifuger à fond rond et plonger les microtubes dans l'azote liquide pour une congélation instantanée.
   
2. Pour 5 mg de tissu, ajouter 300 µl de tampon de lyse glacé et homogénéiser à l'homogénéisateur électrique. Ajouter 300 à 600 µl de tampon de lyse supplémentaire pendant l'homogénéisation.
   
3. Agiter le contenu pendant 2 heures à 4 °C.
   
4. Centrifuger les microtubes à 16 000 × g pendant 20 minutes à 4 °C. Recueillir le surnageant dans un tube propre et le placer sur de la glace. Jeter le culot.

Normalisation de la concentration en protéines totales des échantillons

1. Prendre un petit volume de lysat pour réaliser un dosage d'estimation de la concentration en protéines.
2. Déterminer la concentration en protéines des échantillons inconnus en les comparant aux étalons, en veillant à diluer les étalons dans le même tampon que les échantillons inconnus. L'estimation de la concentration en protéines peut être réalisée avec le réactif de dosage des protéines au bleu de Coomassie (réf. 27813), par dosage à l'acide bicinchoninique (BCA), avec une absorbance à 280 nm.
3. Transférer un volume approprié de chaque lysat dans des microtubes à centrifuger de sorte que tous les échantillons présentent la même concentration en protéines totales.
   
4. Compléter avec une quantité appropriée de tampon de lyse glacé pour que tous les lysats aient le même volume.

Mélanger les échantillons au tampon de charge selon Laemmli

Voici la composition du tampon de charge à utiliser pour préparer les échantillons pour l'électrophorèse.

Tampon de charge selon Laemmli concentré 2 × :

• Bleu de bromophénol (réf. B5525) 0,004 %
• 2-mercaptoéthanol 10 %
• Glycérol (réf. G5516) 20 %
• SDS (réf. 74255) 4 %
• Tris-HCl (réf. T1503) 0,125 M

1. À un volume de lysat cellulaire donné, ajouter le même volume de tampon de charge.
   
2. Porter le mélange à ébullition à 95 °C pendant 5 minutes. Centrifuger à 16 000 × g pendant 5 minutes.
   
3. Ces échantillons peuvent être conservés à -20 °C ou utilisés en électrophorèse sur gel.