Protocole de qPCR universel avec SYBR Green
Présentation de la technologie
Éléments à prendre en compte pour les tests
Méthodes de quantification
Équipement et fournitures
Guide de sélection des mélanges pour PCR
Protocole
Résolution des problèmes
Produits
Références
Présentation de la technologie de qPCR avec SYBR Green
L'avènement de thermocycleurs intégrant la détection par fluorescence a ouvert la voie à une nouvelle application de la PCR. En routine, le résultat critique d'une PCR est la quantité d'amplicons produite à la fin du processus. La PCR quantitative (qPCR) exploite la linéarité de la réaction d'amplification de l'ADN pour déterminer la quantité absolue ou relative d'une séquence connue dans un échantillon. La production d'ADN peut être mesurée grâce à l'incorporation d'une molécule fluorescente rapporteuse dans la réaction.
Figure 1.Présentation de la technologie de qPCR avec SYBR Green
En qPCR, l'amplification de l'ADN est vérifiée après chaque cycle de PCR. Lorsque l'ADN se situe dans la phase linéaire de l'amplification, le niveau de fluorescence dépasse le bruit de fond. Le point à partir duquel la fluorescence devient mesurable est appelé cycle de quantification (Cq) ou cycle seuil (Ct pour "Threshold Cycle" ou Cp pour "Crossing Point"). En utilisant plusieurs dilutions d'une quantité connue d'ADN étalon, il est possible de tracer une courbe étalon représentant le logarithme de la concentration en fonction du nombre de cycles (Cq). La quantité d'ADN ou d'ADNc présente dans un échantillon inconnu peut alors être calculée à partir de sa valeur de Cq.
A) Différentes phases de la réaction :
Ligne de base : La concentration initiale de la matrice est faible ; l'intensité de la fluorescence est donc trop basse pour être détectée et seul le signal du bruit de fond est visible.
Phase exponentielle : Dès que le rendement de la cible a atteint le seuil de détection (ligne rouge), la réaction évolue exponentiellement.
Phase linéaire : Plus la concentration de la matrice augmente, plus le taux d'ADN polymérase disponible et la vitesse de la réaction diminuent.
Plateau : Il n'y a plus suffisamment d'enzyme libre pour poursuivre l'amplification ; la réaction atteint son rendement maximal ou sa phase de plateau.
B) Chaque réaction est caractérisée par le cycle au cours duquel la fluorescence dépasse pour la première fois le seuil de détection. On parle de "cycle de quantification" (Cq). Si le matériel de départ est présent en grande quantité, l'amplification est visible dès les premiers cycles et le Cq est faible. Si le matériel de départ est peu abondant, l'amplification est visible plus tardivement et le Cq est plus élevé. Cette corrélation entre la fluorescence, le Cq et la quantité de produit amplifié permet de quantifier la matrice sur une large plage dynamique.
La PCR en temps réel se prête également à des expériences de quantification relative. Une réaction peut être réalisée avec des amorces spécifiques de chaque région à amplifier, marquées par des colorants fluorescents différents. Plusieurs thermocycleurs quantitatifs du commerce proposent différents canaux de détection. Dans ce système multiplex, la quantité d'ADN ou d'ADNc cible peut être comparée à la quantité d'une séquence domestique, par exemple celle de la GAPDH ou de la β-actine.
NR = non recommandé
X = recommandé
XX = méthode de choix
Éléments à prendre en compte pour les tests
Préparation de l'ADN
La seule étape qui s'avère la plus importante pour la réussite d'une PCR est la préparation de l'ADN, qui doit être de très grande qualité. L'intégrité et la pureté de la matrice d'ADN sont déterminantes. La PCR quantitative comporte plusieurs cycles de réactions enzymatiques et est donc plus sensible aux impuretés (protéines, phénol/chloroforme, sels, EDTA ou autres solvants chimiques, etc.). Ces contaminants peuvent également perturber la détection de la fluorescence. Le rapport des valeurs d'absorbance à 260 nm et à 280 nm donne une estimation de la pureté de l'ADN. Un ADN pur présente un rapport A260/A280 de 1,8 à 2,0. Un rapport plus faible révèle la présence de contaminants, par exemple des protéines.
Matrice
Il faut très peu de copies de l'acide nucléique cible (l'équivalent d'environ 100 pg d'ADNg ou d'ADNc) pour initier une qPCR. Afin de limiter le risque de contamination par des inhibiteurs de la réaction, on veillera à utiliser la plus petite quantité de matrice de départ permettant une quantification précise. Lorsque le matériel de départ est de l'ARN, la conception des amorces et un traitement à la DNase I permettent de limiter les signaux liés à une contamination par de l'ADNg.
Conception des amorces
Que la réaction utilise un colorant se fixant à l'ADN double brin ou une détection chimique par sondes, la conception d'amorces qualitatives fait partie des étapes les plus importantes préalablement à une qPCR. La conception d'amorces de PCR spécifiques devra être réalisée à l'aide d'un logiciel dédié afin d'éviter les complications liées aux dimères d'amorces et aux structures secondaires. L'utilisation d'amorces faiblement concentrées limite l'accumulation de dimères d'amorces et la formation de produits non spécifiques, ce qui s'avère déterminant pour l'emploi du colorant SYBR Green I en PCR quantitative.
dNTP
Les mélanges maîtres pour PCR ou qPCR standard contiennent du dATP, du dCTP, du dGTP et du dTTP. Il existe toutefois des mélanges où le dTTP est remplacé par du dUTP. Les produits de précédentes amplifications réalisées avec du dUTP contiennent de l'uracile à la place de la thymine ; ils sont donc clivables par l'uracile-ADN glycosylase (UNG). L'incubation préalable des amplifications ultérieures avec de l'UNG évite tout risque de contamination entre les réactions. Pour être efficaces, toutes les PCR réalisées en laboratoire doivent utiliser du dUTP.
Concentration en magnésium
La transcriptase inverse, la Taq polymérase et l'exonucléase 5'→3' de la Taq polymérase ont besoin de chlorure de magnésium (MgCl2) pour être actives. Pour les réactions utilisant une sonde à double marquage (DLP), la concentration optimale de Mg2+ se situe généralement entre 3 mM et 6 mM. Une concentration inférieure entraîne généralement la formation d'une plus faible quantité de produits non spécifiques. Il existe des solutions prêtes à l'emploi (prémélanges ReadyMix™) doublement concentrées en chlorure de magnésium 7 mM (concentration finale de 3,5 mM). Un flacon de solution de chlorure de magnésium 25 mM est parfois fourni pour assurer, si nécessaire, l'optimisation de la concentration finale. Certaines expériences peuvent nécessiter un mélange réactionnel sans MgCl2 pour permettre l'utilisation d'une faible concentration, par exemple avec des sondes Scorpion.
Transcriptase inverse
Une transcriptase inverse donnant de hauts rendements d'ADNc tout en conservant son activité à haute température est essentielle à la réussite d'une PCR quantitative après transcription inverse (RT-qPCR). Les performances de l'enzyme à chaud contribuent à déstabiliser les régions de l'ARN possédant une structure secondaire complexe, les rendant ainsi accessibles pour l'hybridation et l'amplification ultérieure. Lors d'une RT-qPCR en une étape, une enzyme performante à chaud permet d'utiliser des amorces à haute température de fusion (Tm) spécifiques du ou des gènes d'intérêt, augmentant la spécificité de la réaction. Dans les protocoles en deux étapes, il est important de veiller à ce que l'enzyme donne un rendement d'ADNc linéaire et proportionnel à partir de l'ARN. La minimisation du nombre de pipetages peut réduire la variabilité. Certains mélanges prêts à l'emploi contiennent des amorces ainsi que d'autres réactifs nécessaires à la transcription inverse, par exemple le mélange ReadyScript® pour la synthèse d'ADNc (RDRT).
Taq polymérase
Comme pour la transcriptase inverse, il est crucial de choisir la Taq polymérase la mieux adaptée à la réaction. Un inconvénient majeur de la Taq polymérase naturelle est son activité résiduelle à basse température. Il en résulte l'hybridation non spécifique d'amorces, et donc, la formation de produits non spécifiques. Des Taq polymérases inhibées par un anticorps ou par un agent chimique (dites "à démarrage à chaud" ou "Hot Start") permettent de régler ce problème en neutralisant l'activité enzymatique jusqu'au démarrage de l'étape de dénaturation à haute température. Pour identifier la polymérase à démarrage à chaud la mieux adaptée à chaque application, nous vous invitons à consulter le guide de sélection des mélanges pour PCR.
Colorant de référence interne selon le type d'instrument
Certains thermocycleurs pour PCR en temps réel ont besoin d'un colorant de charge comme le ROX pour réduire la variabilité du système optique et normaliser les différences d'intensité des signaux. De même, certains thermocycleurs ont besoin de fluorescéine pour créer un "fond virtuel" dans les tests utilisant le colorant SYBR Green I (où il y a très peu de bruit de fond). Ces colorants peuvent être présents dans le prémélange ; ils peuvent aussi être fournis séparément, ce qui permet d'utiliser la concentration adaptée. Dans certains cas, un flacon de colorant de référence interne est fourni pour la normalisation de la réaction. Ce colorant présente un pic d'excitation à 586 nm et un pic d'émission à 605 nm. Sur les instruments, les réglages de base utilisés pour le colorant de référence ROX conviennent à la mesure du colorant de référence interne. Un tel colorant de référence interne est nécessaire pour les systèmes de détection de séquences de marque ABI.
Instruments
Les réactifs sélectionnés doivent être compatibles avec les instruments. Sachant que chaque plateforme utilise un colorant de normalisation différent, on veillera à choisir des réactifs dont les colorants de normalisation sont compatibles (voir annexe 1).
Bon nombre d'instruments de qPCR sont conçus pour permettre la réalisation d'un panel d'applications donné. Comparons par exemple l'instrument ABI 7900 et sa capacité de traitement à haut débit avec chargement automatique de plaques de 384 puits, à l'instrument Illumina Eco qui n'accepte qu'une seule plaque de 48 puits. Le meilleur instrument est bien entendu celui qui répond aux besoins de la recherche. Il est préférable de choisir un instrument équipé d'un logiciel convivial, capable d'accomplir les fonctions les plus recherchées et présentant une certaine flexibilité en termes de sortie de données afin de faciliter les manipulations en aval avec des programmes d'analyse statistique. Cela permet de réduire le temps de formation du personnel, et donc, le délai d'obtention des premiers résultats. D'autres caractéristiques sont également indispensables, comme un bloc de PCR totalement uniforme (écart absolu maximal de 2 pour 1 Cq sur 96 puits répliqués) et un système optique qui excite la fluorescence et en détecte l'émission avec la plus grande sensibilité et la plus grande régularité possible sur une large plage de longueurs d'onde. Cela laisse place à un large choix de fluorophores et permet un multiplexage. D'autres facteurs à prendre en compte sont les coûts de fonctionnement associés à certains consommables, par exemple lorsqu'une plaque de microtitrage spéciale est utilisée pour les réactions, ainsi que la facilité de chargement des plaques ou tubes de format non standard.
Témoins
Un témoin positif est toujours utile pour vérifier le bon fonctionnement des différents composants du kit. Un témoin négatif/sans matrice s'avère nécessaire pour déterminer la présence d'une éventuelle contamination. La détection d'un signal dans le témoin sans matrice confirme la présence d'ADN contaminant ou de dimères d'amorces.
Tampon
Les tampons ou les mélanges maîtres pour PCR contiennent généralement des dNTP, une Taq polymérase, du MgCl2 et des stabilisants. Ils peuvent également contenir du SYBR Green I, du ROX™, de la fluorescéine et des colorants de charge inertes, selon les besoins de la réaction, la méthode de détection et l'instrument utilisé. Les composants du tampon de PCR et les stabilisants sont généralement des produits développés en interne par le fabricant. Acheter chaque ingrédient séparément permet de bénéficier d'une très grande souplesse d'utilisation, chacun d'eux étant ajouté individuellement à la dose optimale. À l'inverse, malgré une moindre souplesse d'utilisation, acheter les ingrédients sous forme de mélange maître augmente la reproductibilité inter-lot et la facilité d'emploi tout en réduisant le nombre d'étapes de pipetage, et donc, les risques d'erreur et de contamination.
Analyse des données
Il convient de suivre en temps réel les instructions de l'instrument utilisé pour la qPCR SYBR Green. Voici quelques informations qui peuvent aider les nouveaux utilisateurs. En général, le nombre de cycles est représenté graphiquement en fonction de la fluorescence. La quantité de matrice présente dans chaque échantillon est déterminée par le cycle seuil (Ct), également appelé cycle de quantification (Cq). Il s'agit du premier cycle où l'on observe une augmentation détectable de la fluorescence due à la formation de produits de PCR. Les cycles qui le précèdent forment la ligne de base. Aucune augmentation détectable de la fluorescence due aux produits de PCR n'y est observée. Le seuil utilisé pour déterminer le moment où la fluorescence devient détectable pour la première fois peut aussi être ajusté manuellement. Il doit toujours être défini sur une courbe d'amplification exponentielle, dans sa partie linéaire, et non dans sa phase de plateau.
Courbes de fusion
L'analyse des courbes de fusion en fin de PCR permet d'analyser le seul produit de PCR d'intérêt. Pour procéder à cette analyse, il convient de suivre en temps réel les instructions de l'instrument. Des réactions successives réalisées avec les mêmes amorces peuvent être modifiées afin de débarrasser le signal des faux-positifs dus à la formation de dimères d'amorces. Pour cela, des données sont collectées lors d'une étape de thermocyclage supplémentaire, où la température doit être comprise entre la température de fusion (Tm) préalablement déterminée des dimères et celle du produit.
Méthodes de quantification
Courbes étalons
Qu'elle soit absolue ou relative, la quantification nécessite des courbes étalons. Pour cela, il convient d'utiliser plusieurs concentrations d'ADN (généralement 5) afin de tracer une courbe étalon permettant de déduire la concentration de l'échantillon inconnu. Chaque concentration doit être évaluée deux fois.
Quantification absolue ou relative
Ce kit pour PCR SYBR Green peut être utilisé pour quantifier l'ADN cible par quantification absolue ou relative. Les techniques de quantification absolue permettent de déterminer la quantité d'ADN cible présente dans l'échantillon initial, tandis que la quantification relative établit un rapport entre la quantité d'ADN cible et la quantité d'un amplicon de référence. L'amplicon de référence présente idéalement une expression constitutive invariante. Bien qu'un gène domestique soit généralement choisi pour remplir cette fonction, il existe d'autres fragments de référence qui répondent mieux aux besoins décrits plus haut1.
La quantification absolue utilise des étalons externes pour déterminer la quantité absolue de l'acide nucléique cible. Pour éviter les différences de quantification dues à l'hybridation, les sites de liaison des amorces des étalons externes doivent être les mêmes que ceux de la séquence cible. L'étalon externe idéal contient des séquences qui sont identiques à la séquence cible ou qui n'en diffèrent que légèrement. Pour une quantification absolue, l'étalon externe et la cible doivent présenter une efficacité d'amplification équivalente. Lorsqu'une construction ou un amplicon approprié est identifié, une courbe étalon de différentes dilutions de l'étalon externe est produite ; cette courbe sert à déterminer la concentration d'échantillons cibles inconnus.
La quantification relative permet quant à elle de calculer le rapport entre la quantité de la matrice cible et la quantité d'une matrice de référence présentes dans un échantillon. Étant donné que cette méthode mesure la quantité de la cible par rapport à un étalon, en principe invariant, la qPCR relative est très souvent utilisée pour mesurer des différences de polymorphismes génétiques, par exemple entre des tissus ou entre des échantillons sains et malades. Parce qu'elle utilise un étalon interne, cette technique a l'avantage de limiter le nombre de modalités différentes pour la préparation et la manipulation des échantillons. Avec les systèmes SYBR, la quantification de la cible et de l'étalon interne doit être réalisée dans des réactions séparées.
La précision d'une quantification relative est conditionnée par le choix de la bonne matrice de référence pour les étalons. Sachant que les résultats sont influencés par la variabilité de l'étalon, il est très important que ce dernier soit adapté1. Certains chercheurs décident de ne pas produire de courbe étalon et d'exprimer la quantité de cible sous la forme d'une fraction de la matrice de référence ; on parle alors de quantification comparative. On peut également supposer que les efficacités d'amplification de la cible et de la matrice de référence sont négligeables, et quantifier la cible à partir de la seule courbe étalon produite pour la séquence de référence. Enfin, la méthode de quantification relative la plus précise consiste à mesurer les efficacités d'amplification de la matrice de référence et de la cible, puis à déterminer un facteur de correction. Cette technique, appelée normalisation1, nécessite un échantillon contenant des concentrations connues de la cible et de la matrice de référence, ainsi que la production de deux courbes étalons.
Détermination de l'efficacité des réactions de PCR
Pour déterminer l'efficacité d'une PCR entre un échantillon de référence et un échantillon cible, il convient de préparer une série de dilutions de chaque cible. La valeur Ct de l'échantillon de référence est soustraite de celle de la cible et la différence obtenue est représentée graphiquement en fonction du logarithme de la quantité de matrice. Si la pente de la droite tracée est inférieure à ± 0,1, on considère que les efficacités d'amplification sont similaires.
Équipement
- Instrument de PCR quantitative
- Microcentrifugeuse
- Hotte à flux laminaire pour la mise en place de la PCR (facultatif)
Fournitures
- Mélange pour qPCR SYBR Green : voir les guides de sélection (partie 1 et partie 2)
- Matrice d'ADN/ADNc : solution d'ADNc diluée au 1/10e pour la détection de cibles moyennement à fortement exprimées, ou diluée du 1/2 au 1/5e pour la détection de transcrits rares, ou 10 ng à 100 ng d'ADNg
- Amorces sens et antisens diluées à la concentration de travail (des solutions de travail de 10 µM suffisent pour la plupart des tests)
- Il existe également des amorces d'expression génique préalablement conçues pour la plupart des organismes modèles (amorces KiCqStart® SYBR® Green, KSPQ12012)
- Pointes de pipettes stériles avec filtre
- Tubes à centrifuger stériles de 1,5 ml avec bouchon à vis (p. ex. CLS430909)
- Tubes pour PCR, choisir des tubes compatibles avec le format souhaité :
- Tubes pour PCR individuels de 200 µl à paroi mince (Z374873 ou P3114)
- Plaques
- Plaques de 96 puits (Z374903)
- Plaques de 384 puits (Z374911)
- Films adhésifs pour plaques
- Film adhésif ThermalSeal RTS™ (Z734438)
- Film ThermalSeal RT2RR™ (Z722553)
- Eau de qualité PCR (W1754)
Protocole
Préparation
- Placer tous les composants de la réaction sur de la glace.
- Mélanger, puis centrifuger brièvement afin que le contenu solide se dépose au fond du tube.
PCR standard avec colorant SYBR Green I
Remarque : Nous avons observé que les tests réalisés avec les prémélanges KiCqStart donnent de meilleurs résultats lorsque la concentration des amorces est plus élevée qu'en PCR classique. Dans les protocoles suivants, nous utilisons une concentration finale de 450 nM qui, selon nos observations, est optimale pour différents tests indépendants.
1. Préparer suffisamment de mélange maître de façon à pouvoir effectuer deux répétitions de chaque échantillon.
a. Veiller à inclure deux répétitions d'un témoin négatif sans matrice (NTC pour "No Template Control").
b. Sélectionner, parmi les tableaux suivants, celui correspondant au réactif de qPCR choisi.
c. Calculer la quantité de réactifs à mélanger. Prévoir 10 % supplémentaires pour compenser les erreurs de pipetage.
d. Bien mélanger en évitant d'introduire des bulles d'air.
Mélange maître pour réactifs KiCqStart :
Mélange maître pour autres prémélanges de qPCR complets :
Mélange maître pour réactifs de qPCR (composants fournis séparément) :
1 La concentration optimale de MgCl2 peut varier de 1 mM à 6 mM.
2 Veuillez consulter l'annexe 1 pour déterminer la concentration du colorant de référence adaptée à votre instrument.
2. Mettre les réactions en place :
a. Pour les réactions témoins (NTC), ajouter 4 µl d'eau dans le tube réactionnel.
b. Pour les réactions expérimentales, ajouter 4 µl de solution d'ADNc dans le tube réactionnel.
c. Centrifuger brièvement tous les tubes. Vérifier visuellement la présence du bon volume d'échantillon au fond de chaque tube ou de chaque puits.
d. Répartir soigneusement 16 µl de mélange maître avec matrice dans les différents tubes ou les différents puits de la plaque pour qPCR.
e. Bien mélanger et centrifuger si nécessaire.
f. Boucher et étiqueter les tubes, ou sceller la plaque et étiqueter les puits (selon les besoins de l'instrument). (Veiller à ce que les étiquettes ne masquent pas le chemin optique du faisceau d'excitation ou de détection de l'instrument.)
3. Analyser les échantillons conformément aux recommandations du fabricant de l'instrument. Des exemples de paramètres de thermocyclage standard et rapide sont présentés ci-dessous.
Paramètres de thermocyclage standards :
Paramètres de thermocyclage rapide :
Remarque : Utiliser la méthode classique des courbes de fusion (collecte des données).
4. Consulter le mode d'emploi de l'instrument pour savoir comment procéder à l'analyse des données.
Annexe 1
Concentration du colorant de référence recommandée pour chaque instrument (pour les réactifs de qPCR où le colorant de référence est fourni séparément)
Guide de résolution des problèmes
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