FAQ sur les kits de purification d'ADN et d'ARN GenElute™-E Single Spin

La liste suivante répertorie les questions fréquemment posées sur les kits de purification d'ADN et d'ARN GenElute™-E Single Spin.

FAQ – Technologie

FAQ – Application

FAQ – Protocole

Les kits de purification d'ADN et d'ARN GenElute-E Single Spin utilisent la chromatographie négative pour isoler les acides nucléiques. Comment cette approche simplifie-t-elle les procédures de travail ?

Au lieu d'optimiser les étapes de fixation, de lavage et de libération dans les préparations classiques de purification par centrifugation sur colonne de silice, la technologie repose sur une séparation : elle permet d'effectuer un fractionnement en une seule étape basé sur la taille des biomolécules, ce qui réduit les impuretés.

Quelles sont les spécificités des enzymes SmartLyse™ ?

Les enzymes SmartLyse™ ciblées réduisent le temps de lyse et permettent d'améliorer l'efficacité du workflow en déchargeant le scientifique de la manipulation fastidieuse des tubes grâce à la suppression des étapes de fixation et de lavage.

Souvent, lors de l'utilisation de colonnes de silice dans le cadre d'une purification, un scientifique peut effectuer une élution dans un plus petit volume afin d'obtenir un échantillon plus concentré. Il peut également procéder à deux élutions pour un meilleur rendement. En quoi cette technologie diffère-t-elle ?

Lors d'une élution dans un plus petit volume à l'aide de silice, une plus forte concentration peut être obtenue. Cependant, on observera également une plus forte concentration des sels résiduels et de l'éthanol nécessaires à la fixation et au lavage de l'échantillon. Grâce à la chromatographie négative, le volume chargé correspond sensiblement au volume récupéré (habituellement, environ 80 à 100 µl), qui est généralement plus concentré que les échantillons d'acides nucléiques isolés à l'aide de silice. Avec la silice, une seconde élution libère généralement plus de contaminants issus de la procédure et moins d'acides nucléiques fragmentés, ce qui est susceptible de donner lieu à une quantification inexacte et à une surestimation du rendement.

Comment la technologie GenElute-E améliore-t-elle l'exactitude de la quantification des acides nucléiques ?

Aucun contaminant issu de la procédure n'est introduit lors de l'utilisation de la chromatographie négative pendant la purification et la réduction des étapes de centrifugation permet de récupérer plus d'acides nucléiques complets. Cette méthode améliore l'exactitude de la quantification en vue des applications en aval et élimine les contaminants susceptibles d'interférer avec ces applications. La fiabilité des expériences est donc améliorée.

Quels autres avantages la technologie GenElute-E offre-t-elle aux chercheurs ?

La suppression des étapes de fixation et de lavage offre une approche plus éco-responsable de l'isolement des acides nucléiques, grâce à la réduction de la quantité de tubes en plastique utilisés et des déchets chimiques issus du flux continu. La technologie GenElute™-E constitue donc une option éco-responsable de chimie verte plus avantageuse pour tous.

J'utilise une enzyme d'amplification exigeante (polymérase). Cette technologie élimine-t-elle les ions Mg+2 de mes préparations ?

Oui ! La technologie de purification GenElute™-E Single Spin diminue la quantité d'ions, ce qui permet d'obtenir des réactions enzymatiques en aval plus efficaces en garantissant une meilleure optimisation de la concentration des composants du tampon enzymatique, sans inhibiteurs "surprises".

Quelle est la composition du tampon de lyse et du tampon de clarification après leur passage dans la résine ?

La présence d'EDTA, de laurylsulfate de sodium (SDS) ou d'excédent de sel peut affecter la PCR/réaction de séquençage...

Les informations relatives au tampon de lyse sont confidentielles, mais nous pouvons vous indiquer qu'il est exempt de sels chaotropiques. Nous utilisons des résines de dessalage. La quantité d'EDTA, de laurylsulfate de sodium (SDS) et de sels est donc diminuée. C'est là toute la beauté de la technologie !

La technologie introduit-elle un éventuel biais dans l'échantillon ?

À l'inverse de certaines technologies de "fixation-lavage-élution", GenElute™-E n'introduit pas de biais, car la séparation est effectuée en fonction de la taille, et non en fonction des éléments fixés et des éléments libérés.

Connaît-on le niveau de stabilité de l'ADN purifié après plusieurs cycles de congélation-décongélation ?

Le niveau de stabilité fluctue en raison de la variabilité des échantillons (recueil des échantillons, concentration, longueur de fragment, séquence [teneur en GC], stockage avant isolement, etc.). Cependant, l'échantillon subit un échange de tampons et passe à travers un tampon de conservation standard inclus dans le kit (1× TE).

Tout d'abord, à propos du cisaillement et de la réduction des dommages de cisaillement associés à des centrifugations multiples sur une colonne à centrifuger, est-ce que cela concerne l'ARN ? Ensuite, comment la colonne de chromatographie négative exclut-elle les grosses protéines/glycoprotéines chargées négativement lors de l'extraction des acides nucléiques (et plus spécifiquement, de l'ARN) ?

• Les extractions d'ARN sont sujettes à une dégradation des fragments, généralement du fait de digestions enzymatiques au sein de l'échantillon (RNases). Par conséquent, il est important d'isoler les acides nucléiques de ces enzymes le plus rapidement possible. Lors d'une procédure classique de préparation par centrifugation avec fixation-lavage-élution, un cisaillement de l'échantillon peut survenir en raison des multiples étapes de centrifugation ainsi que du procédé de fixation/libération de la biomolécule d'une membrane ou d'une bille/résine. Éliminer ces variables de la procédure d'isolement de l'ARN favorise un meilleur contrôle de la qualité des fragments de l'échantillon final. Cependant, certaines applications en aval ne nécessitent pas ce degré de contrôle, car elles sont moins sensibles à ces dégradations. Les contrôles sont utiles, en particulier pour les échantillons présentant des rendements plus faibles, et peuvent faciliter la résolution des problèmes en cas d'échec des procédés en aval.
• Plusieurs méthodes de chromatographie tirent parti des différences entre les biomolécules pour la séparation, comme les ions/la charge pour la silice. La "chromatographie négative" repose sur l'exclusion stérique, qui permet de recueillir les produits de poids moléculaire élevé en premier. Nous comprenons tout à fait le rapprochement intuitif entre notre utilisation du mot "négative" et la charge. Les protéines, qui sont digérées par les enzymes SmartLyse™, traverseront plus lentement la matrice de résine que les molécules d'ARN et resteront dans la colonne après la centrifugation. Astuce : si vous souhaitez recueillir les fragments des protéines digérées avec les autres biomolécules de poids moléculaire plus faible, vous pouvez centrifuger la colonne après la purification à une vitesse plus élevée pour recueillir la fraction qui se déplace plus lentement.