Coulage manuel de gels de polyacrylamide pour PAGE et SDS-PAGE à l'aide des kits de coulage de gels Bis-Tris mPAGE^® TurboMix

• Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)
• Propriétés chimiques des gels de polyacrylamide
• Coulage manuel de gels de polyacrylamide
• Kit de coulage de gels Bis-Tris mPAGE^® TurboMix
• Vidéo de démonstration
• Protocole de coulage rapide mPAGE^® TurboMix
• Préparation des échantillons et analyse des gels
• Guide d'achat

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE)

L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) est une technique fondamentale utilisée pour séparer des protéines et autres macromolécules en fonction de leur mobilité électrophorétique. Les gels de polyacrylamide sont formés par la polymérisation de monomères d'acrylamide et de bis-acrylamide induisant leur réticulation. Ensemble, l'acrylamide et le bis-acrylamide forment des pores à travers lesquels les protéines peuvent migrer.

Les gels de polyacrylamide comportent deux parties : un gel de concentration (stacking gel) et un gel de séparation (resolving gel). Le gel de concentration est composé d'un faible pourcentage d'acrylamide et sert à concentrer les échantillons en une seule bande avant qu'ils n'entrent dans le gel de séparation. Le gel de séparation contient un pourcentage d'acrylamide plus élevé et permet de séparer les protéines selon leur taille. La concentration en acrylamide est en corrélation linéaire avec la taille des pores ; une concentration plus élevée entraînera la formation de pores plus petits dans le gel. Des pores de petite taille sont souhaitables pour la séparation de protéines de faible poids moléculaire.

Propriétés chimiques des gels de polyacrylamide

La méthode PAGE utilise un système de tampons discontinus dans lequel l'ion du tampon de gel est différent de l'ion du tampon de migration. La différence de mobilité électrophorétique entre ces deux ions forme un gradient de tension qui se déplace dans le gel et à travers lequel passent les protéines. Le système de PAGE le plus couramment utilisé est celui à base de Tris-glycine, dans lequel les gels sont composés de Tris-HCl et le tampon de migration, de base Tris et de glycine. Les gels Tris-glycine fonctionnent dans un environnement hautement alcalin, ce qui peut entraîner des modifications indésirables des protéines, comme la désamination et l'alkylation. Cela peut provoquer une distorsion des bandes de protéines ou une perte de résolution des gels Tris-glycine.

En revanche, les gels Bis-Tris utilisent du Bis-Tris et de l'HCl dans le tampon de gel et du MOPS ou du MES dans le tampon de migration. Les gels Bis-Tris fonctionnent à pH neutre, ce qui minimise les modifications des protéines et favorise leur stabilité lors de la migration dans le gel. Cela se traduit par une meilleure résolution des bandes de protéines et une plus grande précision. Les gels Bis-Tris ont également une durée de conservation plus longue que les gels Tris-glycine, qui commencent à s'hydrolyser avec le temps. Les gels Bis-Tris offrent également la possibilité d'être combinés aux tampons de migration à base de MOPS ou de MES. La différence de migration entre ces deux ions permet d'obtenir différentes plages de séparation des protéines. Le MES est privilégié si la protéine d'intérêt est de petite taille (< 50 kDa), tandis que le MOPS est mieux adapté à la séparation de protéines de taille moyenne à grande.

Il est également important de tenir compte du tampon pour échantillon utilisé lors de la préparation des protéines. Dans le cas des gels Tris-glycine, le tampon de Laemmli est généralement utilisé pour dénaturer les protéines et les recouvrir d'ions du SDS chargés négativement. Les échantillons sont alors chauffés à 100 °C pour faciliter la dénaturation. Chauffer le tampon de Laemmli à 100 °C rend le pH très acide, et la combinaison de la chaleur et de l'acidité provoque un clivage préférentiel des protéines aux liaisons peptidiques Asp-Pro (Rittenhouse et Marcus, 1984). Cela provoque l'apparition de produits de dégradation des protéines lors de l'électrophorèse. En revanche, les gels Bis-Tris utilisent un tampon pour échantillon avec LDS, qui maintient le pH alcalin lors de la préparation des échantillons et ne nécessite pas de chauffage au-delà de 70 °C pour dénaturer complètement les protéines. Cette préparation préserve l'intégrité des protéines en minimisant le clivage des liaisons peptidiques Asp-Pro.

Tableau 1. Comparaison des propriétés chimiques des gels Tris-glycine et Bis-Tris

	Tris-glycine	Bis-Tris
pH de fonctionnement	9,5 (alcalin)	7,0 (neutre)
pH du tampon pour échantillon	5,2	8,5
Fronts ioniques	Tris (+) Glycine (-)	Tris (+) MOPS (-) MES (-)
Plage de séparation des protéines	6–400 kDa	6–400 kDa
Stabilité des protéines lors de la séparation	Désamination et alkylation possibles	+++
Effet sur les liaisons peptidiques Asp-Pro	Un chauffage prolongé dans le tampon pour échantillon avec SDS entraîne un clivage des liaisons	Le tampon pour échantillon avec LDS utilise des conditions de chauffage modérées qui préservent les liaisons Asp-Pro
Durée d'exécution	Modérée	Rapide
Durée de conservation	Limitée	4 semaines ou plus

Figure 1. Comparaison des gels Tris-glycine (à gauche) et Bis-Tris (à droite). Des gels Tris-glycine et Bis-Tris sont coulés à la main avec 12 % d'acrylamide et laissés à polymériser pendant une nuit. Ils sont chargés avec le même titre de lysat d'E. coli (pistes 3 à 6), l'étalon protéique mPAGE^® non coloré (pistes 2 et 7) et l'étalon protéique mPAGE^® coloré (piste 1). Les gels sont développés dans du tampon de migration Tris-glycine ou MOPS, colorés au ReadyBlue™ (colorant pour gels protéiques) pendant une heure, et décolorés à l'eau désionisée pendant une heure.

Coulage manuel de gels de polyacrylamide

Même s'il est possible de se procurer des gels de polyacrylamide précoulés pour des applications particulières, comme pour analyser des protéines de différentes tailles sur un gradient d'acrylamide, de nombreux chercheurs préfèrent couler leurs propres gels à la main. Les gels de polyacrylamide coulés manuellement sont peu coûteux par rapport aux gels précoulés ; toutefois, la préparation des réactifs et du matériel nécessaires au coulage peut s'avérer longue et fastidieuse. Une variabilité au niveau de la préparation des tampons de gel peut également poser des problèmes d'uniformité et de qualité des gels.

Kit de coulage de gels Bis-Tris mPAGE^® TurboMix

Les kits de coulage de gels Bis-Tris mPAGE^® TurboMix contiennent des solutions de tampon et d'acrylamide prémélangées, évitant les problèmes de variabilité et de perte de temps liés aux gels coulés à la main. Le kit inclut une solution de séparation (Resolving Solution) contenant 20 % d'acrylamide pour former la partie "séparation" du gel d'acrylamide. Cette solution de séparation peut être diluée à l'eau désionisée jusqu'à atteindre la concentration d'acrylamide souhaitée, entre 8 % et 15 %. Le kit inclut également une solution de concentration (Stacking Solution) contenant 4 % d'acrylamide pour former la partie "concentration" du gel d'acrylamide. Ces solutions sont formulées pour permettre un coulage rapide sans temps d'attente (temps de polymérisation) entre le coulage des gels de séparation et de concentration. Vous trouverez ci-dessous une vidéo de démonstration et un bref protocole.

Vidéo de démonstration : Coulez vos propres gels de polyacrylamide grâce aux kits pour gels Bis-Tris mPAGE^® TurboMix

PROTOCOLE DE COULAGE RAPIDE mPAGE^® TurboMix

1. Préparer le gel de séparation au pourcentage d'acrylamide souhaité en délivrant à la pipette la solution de séparation mPAGE^® TurboMix, de l'eau désionisée, du persulfate d'ammonium (APS) à 10 % et du TEMED dans un bécher en verre ou un tube conique propre. Les volumes présentés dans les tableaux 2 à 4 peuvent être multipliés pour couler plusieurs gels à la fois. REMARQUE : Ajouter l'APS à 10 % et le TEMED juste avant de couler le gel.

Tableau 2 : Préparation des solutions de séparation et de concentration pour couler des gels. Les volumes indiqués sont suffisants pour couler un mini-gel de 7,4 × 8,2 cm de 1 mm d'épaisseur et peuvent être multipliés par n (nombre de gels souhaité) pour couler plusieurs gels à la fois.

(pour un mini-gel de 1 mm d'épaisseur)
Gel de séparation		Gel de concentration
Pourcentage du gel	8 %	10 %	12 %	15 %	4 %
Solution de résolution (Resolving Solution) mPAGE® TurboMix	2,4 ml	3,0 ml	3,6 ml	4,5 ml	–
Solution de concentration (Stacking Solution) mPAGE® TurboMix	–	–	–	–	2 ml
Eau désionisée	3,6 ml	3,0 ml	2,4 ml	1,5 ml	–
APS à 10 %	30 µl	30 µl	30 µl	30 µl	20 µl
TEMED	3 µl	3 µl	3 µl	3 µl	2 µl

Tableau 3. Préparation des solutions de séparation et de concentration pour couler des gels. Les volumes indiqués sont suffisants pour couler un mini-gel de 7,4 × 8,2 cm de 0,75 mm d'épaisseur et peuvent être multipliés par n (nombre de gels souhaité) pour couler plusieurs gels à la fois.

(pour un mini-gel de 0,75 mm d'épaisseur)
Gel de séparation		Gel de concentration
Pourcentage du gel	8 %	10 %	12 %	15 %	4 %
Solution de résolution (Resolving Solution) mPAGE® TurboMix	1,8 ml	2,25 ml	2,7 ml	3,38 ml	–
Solution de concentration (Stacking Solution) mPAGE® TurboMix	–	–	–	–	1,5 ml
Eau désionisée	2,7 ml	2,25 ml	1,8 ml	1,12 ml	–
APS à 10 %	22,5 µl	22,5 µl	22,5 µl	22,5 µl	15 µl
TEMED	2,25 µl	2,25 µl	2,25 µl	2,25 µl	1,5 µl

Tableau 4. Préparation des solutions de séparation et de concentration pour couler des gels. Les volumes indiqués sont suffisants pour couler un mini-gel de 7,4 × 8,2 cm de 1,5 mm d'épaisseur et peuvent être multipliés par n (nombre de gels souhaité) pour couler plusieurs gels à la fois.

(pour un mini-gel de 1,5 mm d'épaisseur)
Gel de séparation		Gel de concentration
Pourcentage du gel	8 %	10 %	12 %	15 %	4 %
Solution de résolution (Resolving Solution) mPAGE® TurboMix	3,6 ml	4,5 ml	5,4 ml	6,75 ml	–
Solution de concentration (Stacking Solution) mPAGE® TurboMix	–	–	–	–	3,0 ml
Eau désionisée	5,4 ml	4,5 ml	3,6 ml	2,25 ml	–
APS à 10 %	45 µl	45 µl	45 µl	45 µl	30 µl
TEMED	4,5 µl	4,5 µl	4,5 µl	4,5 µl	2 µl

2. Préparer le gel de concentration en délivrant à la pipette la solution de concentration mPAGE^® TurboMix dans un autre bécher en verre ou tube conique propre et ajouter la quantité nécessaire de TEMED et d'APS à 10 %. REMARQUE : Ajouter l'APS à 10 % et le TEMED juste avant de couler le gel.
3. Mélanger délicatement les réactifs en évitant d'y introduire des bulles d'air.
4. À l'aide d'une pipette sérologique, remplir chaque cassette de gel de séparation jusqu'à la hauteur souhaitée.
5. Positionner la pipette sérologique au milieu de la cassette et ajouter délicatement le gel de concentration, en remplissant jusqu'en haut de la plus petite plaque. Il est possible qu'un creux se forme à l'emplacement de la pipette, mais il se nivellera.
6. Insérer rapidement et avec précaution le peigne, en évitant de piéger des bulles d'air sous les dents.
7. Laisser polymériser les gels pendant 1 heure.
8. Les gels peuvent être utilisés immédiatement ou enveloppés dans du papier absorbant imbibé d'eau désionisée et conservés dans un récipient étanche à l'air à 4 °C pendant un maximum de 4 semaines.

Préparation des échantillons et analyse des gels

1. Les gels Bis-Tris nécessitent un tampon de charge pour échantillon avec LDS, qui est plus alcalin que le tampon de charge avec SDS. Les échantillons peuvent être réduits avec du DTT ou du β-mercaptoéthanol, ou être utilisés sans réduction, selon l'application. Préparer les échantillons comme indiqué dans le tableau 5.
   

Tableau 5. Exemple de préparation d'échantillons pour électrophorèse PAGE. La concentration finale du tampon pour échantillon avec LDS doit être de 1 ×. La concentration finale du DTT doit être de 0,1 M.

	Réduit	Non réduit
Échantillon	6,5 à X µl	7,5 à X µl
Eau désionisée	X µl	X µl
Tampon LDS concentré 4 ×	2,5 µl	2,5 µl
DTT 1 M	1 µl	–
Volume total	10 µl	10 µl

2. Chauffer les échantillons pendant 10 minutes à 70 °C (ne pas faire bouillir).
3. Déposer les échantillons et les étalons protéiques dans les puits.
4. Ajouter le même volume de tampon de charge concentré 1 × dans les puits vides.
5. Les gels peuvent être séparés sous 200 V jusqu'à ce que le colorant ou l'étalon protéique atteigne le bas du gel, soit environ 30 à 60 minutes selon le pourcentage du gel.