Impacto do método de purificação GenElute™-E na precisão da quantificação de DNA e nos processos enzimáticos a jusante (downstream)
Esses métodos de ligar-lavar-eluir são tediosos, exigindo várias etapas de lavagem e centrifugação. Etapas repetidas de centrifugação podem resultar em um cisalhamento significativo do DNA. Além disso, os sais caotrópicos e outros contaminantes podem ser facilmente transportados para o DNA ou RNA eluído, afetando a pureza e a quantificação finais, bem como os processos enzimáticos downstream (a jusante), como a PCR.
Avaliamos um novo sistema de purificação de ácidos nucleicos de rotação única que elimina a necessidade de etapas de lavagem com etanol e de ligação com alto teor de sal. Os kits de purificação de DNA e RNA GenElute™-E empregam um método de cromatografia negativa dependente de exclusão de tamanho para separar moléculas grandes de DNA e RNA de ácidos nucleicos de proteínas menores, lipídios e componentes iônicos em células, tecidos, sangue e outras amostras (Figuras 1-2).
Figura 1.Purificação de ácido nucleico usando técnicas de cromatografia negativa (exclusão de tamanho).
Figura 2.Eluição de DNA purificado e retenção de proteínas, lipídios e outras moléculas usando o kit de alto rendimento de DNA de sangue com centrifugação única GenElute™-E com amostras de sangue de camundongo. A) Espectros de absorção do DNA genômico purificado (linha vermelha). B) Espectros de absorção do retentado da coluna com centrifugação GenElute™-E (linha preta) sobrepostos aos espectros de DNA purificado (vermelho). Os espectros de retentado mostram proteínas e outros contaminantes com DO de ~280nm ou ≤240nm. Observe a mudança de escala no eixo y.
Avaliamos o impacto do método de purificação de ácidos nucleicos sobre as impurezas que interferem na quantificação e nos processos enzimáticos downstream (a jusante). Para esses estudos de comparação, o DNA genômico foi preparado usando a tecnologia de purificação com centrifugação única GenElute™-E ou a tecnologia clássica de preparação por centrifugação através de ligação/lavagem/eluição e com base em sílica do Fornecedor X. A pureza do ácido nucleico foi avaliada usando três métodos:
- Espectrofotometria UV (razão de densidade óptica medida por A260 nm/280 nm e A260 nm/230 nm)
- Eletroforese em gel
- PCR quantitativa (qPCR)
Os resultados indicam que os sistemas de purificação de DNA e RNA com centrifugação única GenElute™-E proporcionam maior pureza do que as técnicas atuais de preparação de centrifugação de sílica, o que leva a uma quantificação mais precisa e à diminuição da interferência de contaminantes em processos enzimáticos downstream (a jusante), como a PCR.
Avaliação de impurezas introduzidas durante a preparação de ácidos nucleicos
Interferência na quantificação por espectrofotometria ultravioleta (UV)
Contaminantes biológicos comuns, como proteínas, ácidos nucleicos fragmentados, ssDNA, RNA (se estiver medindo DNA), primers e sais caotrópicos de protocolos de extração e purificação podem levar a uma superestimação da concentração de ácido nucleico. Algumas dessas impurezas podem ser medidas por meio de espectrofotometria ultravioleta (UV). Nesse método, a luz UV é passada através da amostra purificada de DNA ou RNA. A absorção da amostra em vários comprimentos de onda é medida.
A absorção a 260 nm (A260) é usada para medir o ácido nucleico. A absorção a 280 nm (A280) é usada para medir a proteína contaminante na amostra. A relação A260/A280 pode ser usada para estimar a pureza da amostra com relação a contaminantes de proteínas. O DNA de alta pureza terá uma relação A260/A280 ≥ 1,8. Uma relação menor indica contaminação por proteína na preparação final.
A absorção a 230 nm (A230) pode ser usada para identificar a presença de contaminantes químicos, como sais caotróficos. O ideal é que a relação A260/A230 seja maior que 2,0 para que haja interferência química mínima em processos enzimáticos, como a PCR. É fundamental avaliar essa relação quando são necessárias amostras de alta pureza.
O espectro de absorção, a relação A260/280 e a relação A260/230 foram avaliados para os sistemas de purificação de DNA e RNA com centrifugação única GenElute™-E usando amostras de sangue. Os resultados foram comparados com os obtidos na purificação de preparação com centrifugação de sílica das mesmas amostras usando um produto concorrente (Figura 3 e Tabela 1). Os dados sugerem que os sistemas de purificação GenElute™-E proporcionam maior pureza do DNA genômico com menos contaminantes biológicos e químicos na preparação da amostra final em comparação com os métodos de preparação de ligação a sílica/lavagem/eluição.
Figura 3.Espectros de absorção de UV do DNA genômico preparado a partir do sangue usando A) kit de preparação com centrifugação para purificação de DNA à base de sílica do Fornecedor X ou B) kits de purificação de DNA por cromatografia negativa com centrifugação única GenElute™-E. Gráfico inserido medido na concentração 10X da fração eluída. As impurezas são detectadas somente nas frações de eluição de sílica. As linhas pretas mostram os espectros da amostra purificada usando o método indicado com qualquer impacto de contaminante do processo. As linhas vermelhas são espectros da amostra purificada sem contaminantes do processo, usados como controles de linha de base. As linhas laranja são espectros para o método de purificação sem usar uma amostra real, mostrando o impacto do contaminante do processo na leitura espectrofotométrica.
Impurezas de DNA cisalhado e de ácidos nucleicos de baixo peso molecular avaliadas por eletroforese em gel
A separação de tamanhos por eletroforese em gel fornece uma avaliação visual e quantitativa da pureza da amostra. O DNA genômico maior migra mais lentamente do que os fragmentos menores de DNA e RNA. As bandas resultantes podem ser observadas ou quantificadas usando um corante fluorescente.
As amostras de DNA purificado preparadas a partir de tecido hepático de camundongo usando kits de preparação com centrifugação à base de sílica (Fornecedor X) ou cromatografia negativa por exclusão de tamanho (kits de purificação de DNA com centrifugação única GenElute™-E) foram separadas em um gel de agarose. O SYBR Green foi usado como corante de ácido nucleico. Para normalizar os resultados, a mesma massa de DNA de cada amostra purificada foi carregada em cada pista do gel. A visualização do gel de agarose em um transiluminador mostrou que bandas únicas e mais escuras de DNA genômico foram obtidas usando a cromatografia negativa (exclusão de tamanho) em comparação com o método de purificação baseado em sílica (Figura 4).
As amostras eluídas das colunas com centrifugação de membrana de sílica apresentaram bandas mais fracas na extremidade inferior do gel, o que é consistente com a contaminação de pequenos moléculas de RNA ou moléculas de DNA cisalhadas na preparação final. Como a carga do gel foi normalizada em relação ao DNA na amostra (conforme determinado pela absorção em 260 nm), esses dados sugerem que o rendimento do DNA genômico é superestimado por esse método, pois as moléculas de ácido nucleico menores contaminantes também contribuem para a medição da absorção. A banda única de DNA de maior intensidade obtida usando o método de cromatografia negativa GenElute™-E (exclusão de tamanho) sugere maior pureza do DNA genômico dessas amostras de tecido. Os resultados foram quantificados usando métodos fluorométricos (Figura 5).
Figura 4.Eletroforese em gel de DNA genômico purificado de amostras de tecido hepático de camundongo. O tecido de camundongo foi purificado usando métodos de preparação com centrifugação à base de sílica (Fornecedor X) ou cromatografia negativa por exclusão de tamanho (kits de purificação de DNA com centrifugação única GenElute™-E). As amostras foram ajustadas de modo que a mesma quantidade de DNA fosse carregada em cada pista do gel de agarose. Os resultados sugerem a presença de RNA contaminante ou DNA cisalhado nas amostras purificadas usando o método à base de sílica.
Figura 5.Rendimento calculado de DNA genômico (gDNA) e quantidades de RNA contaminante ou DNA cortado de amostras de tecido de fígado de camundongo. As amostras foram purificadas usando métodos de preparação com centrifugação à base de sílica (Fornecedor X) ou cromatografia negativa por exclusão de tamanho (kits de purificação de DNA com centrifugação única GenElute™-E). As quantidades de DNA foram calculadas pela quantificação do sinal fluorescente do corante verde SYBR. Os resultados mostram quantidades pequenas, mas significativas, de contaminantes de RNA ou DNA cisalhado nas amostras preparadas usando colunas de spin de purificação à base de sílica.
Interferência em qPCR
Os métodos de purificação à base de sílica introduzem sais desnaturantes e solventes orgânicos, como o etanol, na amostra que está sendo purificada. Esses contaminantes podem ser facilmente transferidos para aplicações downstream (a jusante) e levar à inibição de reações enzimáticas. A remoção desses contaminantes pode tornar os métodos enzimáticos, como a qPCR, mais sensíveis e robustos.
Para avaliar a presença de contaminantes que inibem os processos enzimáticos, o DNA genômico das amostras de rim de camundongo foi purificado usando cada método de purificação com centrifugação. As amostras finais foram usadas em experimentos de análise de qPCR (Figura 6). O gene correspondente à beta-actina também foi amplificado como um controle endógeno. Os dados mostram que as curvas de amplificação para amostras purificadas com sílica foram deslocadas para a direita em comparação com as amostras preparadas usando o método de purificação por cromatografia negativa GenElute™-E (exclusão de tamanho). Isso sugere a presença de contaminantes interferentes ou um rendimento inferior ao calculado nas amostras purificadas com sílica.
Figura 6.Análise de qPCR para a determinação de contaminantes interferentes em preparações de DNA genômico. A) Curvas de amplificação para DNA genômico preparado a partir de tecido renal de camundongo usando um kit de preparação com centrifugação à base de sílica do Fornecedor X (curvas azuis) e o kit de preparação com centrifugação GenElute™-E para cromatografia negativa (exclusão de tamanho) (curvas laranja). As curvas para as amostras purificadas com sílica são deslocadas para a direita em comparação com as amostras purificadas com GenElute™-E, sugerindo a presença de contaminantes interferentes ou a superestimação da concentração inicial nas preparações de sílica. B) Cálculos de Cq usando o gene β-actina como referência de controle endógeno.
Conclusões
Os kits de purificação de DNA e RNA com centrifugação única GenElute™-E oferecem um método conveniente de cromatografia negativa para a purificação de ácidos nucleicos com base na exclusão de tamanho. Esses kits oferecem uma alternativa às tradicionais preparações com centrifugação à base de sílica, com pureza aprimorada, conforme evidenciado por espectrofotometria UV, eletroforese em gel e qPCR.
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